Rolle des Wachstumsfaktors BDNF (brain - derived neurotrophic factor) in der Hypoxie - induzierten Pulmonalen Hypertonie und Rechtsherzhypertrophie im Mausmodell
Seiten
2022
VVB Laufersweiler Verlag
978-3-8359-7034-2 (ISBN)
VVB Laufersweiler Verlag
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Pulmonale Hypertonie (PH) wird definiert durch eine Erhöhung des pulmonalarteriellen Druckes sowie des pulmonalen Gefäßwiderstandes, wobei präkapilläre Formen durch einen Gefäßumbau pulmonaler Gefäße charakterisiert sind. Die langanhaltende Druckerhöhung im Lungenkreislauf führt zur Nachlasterhöhung für das rechte Herz, was in einer rechtsventrikulären Hypertrophie und final in einem Rechtsherzversagen resultiert. Aktuelle Therapien können die Progression einer PH - Erkrankung lediglich hinauszögern, nicht aber heilen. Ultima ratio steht aktuell immer noch die Lungen- bzw. Herz - Lungentransplantation für Patienten, die an einer schweren Form der PH erkrankt sind, im Vordergrund.
Die Mechanismen, die dem pathognomonischen Gefäßumbau zu Grunde liegen, konnten bislang nicht vollständig aufgeklärt werden. Ein Ungleichgewicht zwischen anti - apoptotischen und pro - proliferativen Faktoren, die den Gefäßumbau bei PH maßgeblich beeinflussen, wird als das Schlüsselereignis angesehen. In diesem Zusammenhang stehen Wachstumsfaktoren, die über Tyrosin - Kinasen die Proliferation steigern, aktuell im Fokus der Wissenschaft. Erhöhte Level des brain - derived neurotrophic factor (BDNF), ein Wachstumsfaktor, dessen Rolle vor allem aus dem zentralen Nervensystem bekannt ist, wobei BDNF das neuronale Wachstum, die Differenzierung und das Überleben von Neuronen reguliert, konnte bereits in den Gefäßen von PH - Patienten nachgewiesen werden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass BDNF in vitro die Proliferation von humanen pulmonalen arteriellen glatten Muskelzellen (pulmonary artery smooth muscle cells, PASMC) steigern kann, diese aber auch BDNF ins Medium freisetzen können.
Basierend auf diesen Daten war das Ziel der vorliegenden Arbeit, die Bedeutung von BDNF in der Pathogenese der PH sowie der Rechtsherzhypertrophie genauer aufzuklären.
Als erstes wurden in vitro Versuche an isolierten Maus PASMC durchgeführt. Der pro - proliferative Effekt von BDNF konnte auch in Maus PASMC bestätigt werden. Darüber hinaus konnte eine Hochregulation der BDNF mRNA Expression sowie der mRNA Expression des hoch - affinen Tyrosin - Kinase Rezeptors (tyrosin - kinase receptor B, TrkB) nach Hypoxieexposition (1 % Sauerstoff) in Maus PASMC gefunden werden. Die Freisetzung des BDNF - Proteins war ebenfalls nach Hypoxieexposition signifikant erhöht, wodurch der BDNF - TrkB Signalweg ein möglicher Schlüsselfaktor in der Progression des Gefäßremodelings in PH sein kann.
Somit sollte als nächstes die Rolle des BDNF - TrkB Signalweges im Hypoxie - Mausmodell evaluiert werden, wobei die Mäuse vier Wochen in Kammern mit einer Sauerstoffkonzentration von 10 % gehalten wurden. Dies ist ein Zeitraum, in dem sich die pathognomonischen Veränderungen einer PH Erkrankung manifestieren. Da homozygote BDNF - Knockout Mäuse nicht lebensfähig sind, wurden Mäuse verwendet, in denen über die Gabe von Tamoxifen die BDNF - Expression spezifisch in den glattmuskulären Zellen (smooth muscle cells, SMC) ausgeschaltet wurde. Die Ergebnisse der hämodynamischen Messungen, die Parameter des Rechtsherzremodeling sowie des charakteristischen Gefäßumbaus verhielten sich vier Wochen nach Hypoxieexposition in den induzierbaren SMC - spezifischen BDNF Knockout Mäusen nicht signifikant unterschiedlich im Vergleich zu den nicht-BDNF - defizienten Kontrollgruppen. Trotzdem zeigten die SMC - spezifischen BDNF Knockout Mäuse nach vierwöchiger Hypoxieexposition in der echokardiografischen Verlaufskontrolle eine verminderte rechtsventrikuläre Dilatation (RVID) sowie eine bessere rechtsventrikuläre systolische Funktion (TAPSE) im Vergleich zu den nicht BDNF - defizienten Kontrollgruppen, wohingegen alle weiteren Parameter dieselbe Ausprägung zeigten. Eine Beeinflussung der kardialen nervalen Aktivität durch den SMC - BDNF Knockout könnte eine mögliche Erklärung für diese Ergebnisse sein.
Um die maximalen Effekte durch die BDNF - Defizienz im rechten Herzen zu untersuchen, wurden heterozygote BDNF Mäuse (BDNF+/-) und deren Wurfgeschwister in einem banding Modell (pulmonalarteriellen banding; PAB) untersucht. Dabei führt das Setzen eines Metallclips um die Pulmonalarterie zu einer Nachlasterhöhung auf den rechten Ventrikel und ermöglicht die Erforschung der Rechtsherzhypertrophie unabhängig von der pulmonalen Strombahn sowie dem hypoxischen Stimulus. Die Ergebnisse der hämodynamischen Messungen, die morphologischen Parameter für das Ausmaß einer Rechtsherzhypertrophie sowie das Ausmaß der Fibrose im rechten Ventrikel waren in beiden Versuchsgruppen nicht signifikant unterschiedlich. Darüber hinaus konnte keine Veränderung in der mRNA - Expression im rechten Ventrikel von extrazellulären Matrixproteinen, wie Kollagen - 1, - 3, MMP - 2 und TIMP - 2 sowie der kardialen Marker ANP und BNP, drei Wochen nach der PAB - Operation zwischen den Gruppen detektiert werden. Allerdings, passend zu den Daten, die im chronischen Hypoxiemodell erhoben wurden, zeigten die BDNF+/- Mäuse eine verminderte rechtsventrikuläre Dilatation in der echokardiographischen Verlaufskontrolle drei Wochen nach der PAB - Operation im Vergleich zu der Wildtyp Kontrolle.
Außerdem wurde die BDNF - Plasmakonzentration von PH - Patienten sowie von Patienten ohne PH bestimmt und in Korrelation mit den invasiv erhobenen hämodynamischen Messungen analysiert. Die BDNF - Konzentration zeigte eine signifikant negative Korrelation zum mittleren pulmonalen arteriellen Druck (mean pulmonary artery pressure; mPAP) sowie pulmonalarteriellen Widerstand (pulmonary vascular resistance; PVR), wobei niedrige BDNF - Plasmakonzentrationen mit einer schweren PH assoziiert werden konnten. Im Gesamtmodell zeigte sich daher nach Gruppierung der Patienten ein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen (Kontrollgruppe versus präkapillärer bzw. prä- / postkapillärer Gruppe).
Zusammenfassend:
1) BDNF erhöht die Proliferation von PASMC in vitro, wohingegen der BDNF spezifische - SMC Knockout dem durch chronische Hypoxie - induzierten Gefäßumbau im Hypoxiemodell in der Maus nicht entgegen wirken konnte. Vermutlich hat BDNF aus anderen Zellen die PASMC Proliferation beeinflusst.
2) Die BDNF - Defizienz ist protektiv gegenüber rechtsventrikulärer Dilatation, sowohl im chronischen Hypoxiemodell als auch im PAB - Modell, als Ursache kommen systemische Faktoren (veränderte Sympathikusaktivierung) in Betracht.
3) Erniedrigte BDNF - Plasmaspiegel in PH - Patienten korrelieren mit dem Schweregrad der PH. Weitere Experimente sind nötig, um die Rolle von BDNF im pulmonalen Gefäßumbau und Rechtsherzversagen sowie den Nutzen als potentiellen PH - Biomarker genauer zu definieren. Pulmonary hypertension (PH) is defined by elevation of pulmonary arterial pressure (mPAP) and pulmonary vascular resistance (PVR), with pre - capillary forms of PH also characterized by vascular remodeling of pulmonary vessels. Long lasting elevation of pulmonary pressure causes an increase in right ventricular (RV) afterload, which results in right heart hypertrophy and finally right heart failure. PH remains an incurable disease and available therapies can only delay the progression of PH. Currently, lung transplantation is the only therapeutic option for patients with severe PH.
The mechanisms underlying the pathognomonic vascular remodeling has not yet been fully elucidated. An imbalance between anti-apoptotic and pro-proliferative factors is suggested to play a key role in the development of pulmonary vascular remodeling in PH. Recent studies in the PH field, are focused on various growth factors, which activates tyrosine kinases. Elevated levels of a growth factor called brain - derived neurotrophic factor (BDNF), mostly known for its effect in the central nervous system where it regulates neuronal growth, differentiation and survival of neurons, were found in pulmonary vessels of PH patients. In addition, it has been shown that BDNF can be released from human pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) in vitro, and that this growth factor also regulates the PASMC proliferation. Against this background, the aim of this study was to clarify the role of BDNF in the pathogenesis of PH and right heart hypertrophy.
First, in vitro experiments were performed on isolated mouse PASMC. In the study, the pro-proliferative effect of BDNF found in human PASMC was confirmed in mouse PASMC. In addition, the mRNA expression of BDNF as well as high-affinity tyrosine kinase receptor (tyrosine kinase receptor B, TrkB) was found to be up - regulated in mouse PASMC after hypoxia exposure (1 % oxygen). The release of the BDNF protein was also significantly increased after hypoxia exposure, indicating that BDNF-TrkB signaling pathway is a possible key factor in the progression of vascular remodeling in PH.
Next, the role of the BDNF - TrkB signaling pathway was further evaluated in the hypoxic mouse model of PH by exposing mice to hypoxia (10 % O2) for four weeks. The chronic hypoxia mouse model of PH is known to be manifested by pathognomonic changes, similar to human PH. Since homozygous BDNF knockout is lethal, the smooth muscle cell (SMC) - specific BDNF knockout induced by tamoxifen was used. The hemodynamic parameters, right ventricular remodeling and pulmonary vascular remodeling were not significantly changed in the inducible SMC - specific BDNF knockout mice after four - week exposure to hypoxia, as compared to the non-BDNF - deficient control groups. Nevertheless, the SMC - specific BDNF knockout mice showed reduced right ventricular dilatation (RVID) and improved right ventricular systolic function (TAPSE), compared to the non - BDNF - deficient control groups after hypoxic exposure. All other echocardiographic parameters showed the same pattern in all genotypes. The obtained results indicate that the SMC - BDNF knockout has an impact on cardiac neural activity.
In order to examine the maximum effects of BDNF deficiency in the right heart, heterozygous BDNF knockout mice (BDNF+/-) and their littermates were subjected to pulmonary artery banding (PAB). Application of a metal clip around the pulmonary artery resulted in an increase in the right ventricle afterload, thus enabling the investigation of right heart hypertrophy independently of the pulmonary circulation as well as the hypoxic stimulus. The hemodynamic measurements showed that the morphological parameters of right heart hypertrophy and fibrosis in the right ventricle were not significantly different between the two experimental groups. In addition, there were no changes in mRNA expression level in the right ventricle of extracellular matrix proteins, such as collagen - 1, - 3, MMP - 2, and TIMP - 2, as well as the cardiac markers, ANP and BNP, between groups three weeks after PAB. However, BDNF+/- mice showed decreased right ventricular dilatation in echocardiographic follow - up three weeks after PAB surgery compared to wildtype controls, which is in line with the results obtained from the chronic hypoxia model.
In addition, plasma levels of BDNF were determined in PH and non - PH patients, and correlated with invasive hemodynamic parameters. The BDNF concentration showed a significant negative correlation with mPAP and PVR, indicating that low BDNF plasma concentrations could be associated with severe PH. In general, there was a significant difference between the analyzed groups of PH patients (control group versus pre - capillary or pre - / post - capillary group).
In conclusion:
1) BDNF increases PASMC proliferation in vitro, however, in vivo BDNF specific-SMC knockout did not counteract the chronic hypoxia - induced vascular remodeling in the mouse hypoxia model of PH. Presumably, BDNF released from other cell types might has an impact on the PASMC proliferation.
2) BDNF deficiency is protective against right ventricular dilatation in both chronic hypoxia and PAB model, suggesting the involvement of systemic factors (altered sympathetic activation).
3) The lower BDNF plasma level in PH patients correlates with the severity of the disease. Further studies are needed to define the role of BDNF in vascular remodeling and right heart failure as well as its relevance as a potential PH biomarker.
Die Mechanismen, die dem pathognomonischen Gefäßumbau zu Grunde liegen, konnten bislang nicht vollständig aufgeklärt werden. Ein Ungleichgewicht zwischen anti - apoptotischen und pro - proliferativen Faktoren, die den Gefäßumbau bei PH maßgeblich beeinflussen, wird als das Schlüsselereignis angesehen. In diesem Zusammenhang stehen Wachstumsfaktoren, die über Tyrosin - Kinasen die Proliferation steigern, aktuell im Fokus der Wissenschaft. Erhöhte Level des brain - derived neurotrophic factor (BDNF), ein Wachstumsfaktor, dessen Rolle vor allem aus dem zentralen Nervensystem bekannt ist, wobei BDNF das neuronale Wachstum, die Differenzierung und das Überleben von Neuronen reguliert, konnte bereits in den Gefäßen von PH - Patienten nachgewiesen werden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass BDNF in vitro die Proliferation von humanen pulmonalen arteriellen glatten Muskelzellen (pulmonary artery smooth muscle cells, PASMC) steigern kann, diese aber auch BDNF ins Medium freisetzen können.
Basierend auf diesen Daten war das Ziel der vorliegenden Arbeit, die Bedeutung von BDNF in der Pathogenese der PH sowie der Rechtsherzhypertrophie genauer aufzuklären.
Als erstes wurden in vitro Versuche an isolierten Maus PASMC durchgeführt. Der pro - proliferative Effekt von BDNF konnte auch in Maus PASMC bestätigt werden. Darüber hinaus konnte eine Hochregulation der BDNF mRNA Expression sowie der mRNA Expression des hoch - affinen Tyrosin - Kinase Rezeptors (tyrosin - kinase receptor B, TrkB) nach Hypoxieexposition (1 % Sauerstoff) in Maus PASMC gefunden werden. Die Freisetzung des BDNF - Proteins war ebenfalls nach Hypoxieexposition signifikant erhöht, wodurch der BDNF - TrkB Signalweg ein möglicher Schlüsselfaktor in der Progression des Gefäßremodelings in PH sein kann.
Somit sollte als nächstes die Rolle des BDNF - TrkB Signalweges im Hypoxie - Mausmodell evaluiert werden, wobei die Mäuse vier Wochen in Kammern mit einer Sauerstoffkonzentration von 10 % gehalten wurden. Dies ist ein Zeitraum, in dem sich die pathognomonischen Veränderungen einer PH Erkrankung manifestieren. Da homozygote BDNF - Knockout Mäuse nicht lebensfähig sind, wurden Mäuse verwendet, in denen über die Gabe von Tamoxifen die BDNF - Expression spezifisch in den glattmuskulären Zellen (smooth muscle cells, SMC) ausgeschaltet wurde. Die Ergebnisse der hämodynamischen Messungen, die Parameter des Rechtsherzremodeling sowie des charakteristischen Gefäßumbaus verhielten sich vier Wochen nach Hypoxieexposition in den induzierbaren SMC - spezifischen BDNF Knockout Mäusen nicht signifikant unterschiedlich im Vergleich zu den nicht-BDNF - defizienten Kontrollgruppen. Trotzdem zeigten die SMC - spezifischen BDNF Knockout Mäuse nach vierwöchiger Hypoxieexposition in der echokardiografischen Verlaufskontrolle eine verminderte rechtsventrikuläre Dilatation (RVID) sowie eine bessere rechtsventrikuläre systolische Funktion (TAPSE) im Vergleich zu den nicht BDNF - defizienten Kontrollgruppen, wohingegen alle weiteren Parameter dieselbe Ausprägung zeigten. Eine Beeinflussung der kardialen nervalen Aktivität durch den SMC - BDNF Knockout könnte eine mögliche Erklärung für diese Ergebnisse sein.
Um die maximalen Effekte durch die BDNF - Defizienz im rechten Herzen zu untersuchen, wurden heterozygote BDNF Mäuse (BDNF+/-) und deren Wurfgeschwister in einem banding Modell (pulmonalarteriellen banding; PAB) untersucht. Dabei führt das Setzen eines Metallclips um die Pulmonalarterie zu einer Nachlasterhöhung auf den rechten Ventrikel und ermöglicht die Erforschung der Rechtsherzhypertrophie unabhängig von der pulmonalen Strombahn sowie dem hypoxischen Stimulus. Die Ergebnisse der hämodynamischen Messungen, die morphologischen Parameter für das Ausmaß einer Rechtsherzhypertrophie sowie das Ausmaß der Fibrose im rechten Ventrikel waren in beiden Versuchsgruppen nicht signifikant unterschiedlich. Darüber hinaus konnte keine Veränderung in der mRNA - Expression im rechten Ventrikel von extrazellulären Matrixproteinen, wie Kollagen - 1, - 3, MMP - 2 und TIMP - 2 sowie der kardialen Marker ANP und BNP, drei Wochen nach der PAB - Operation zwischen den Gruppen detektiert werden. Allerdings, passend zu den Daten, die im chronischen Hypoxiemodell erhoben wurden, zeigten die BDNF+/- Mäuse eine verminderte rechtsventrikuläre Dilatation in der echokardiographischen Verlaufskontrolle drei Wochen nach der PAB - Operation im Vergleich zu der Wildtyp Kontrolle.
Außerdem wurde die BDNF - Plasmakonzentration von PH - Patienten sowie von Patienten ohne PH bestimmt und in Korrelation mit den invasiv erhobenen hämodynamischen Messungen analysiert. Die BDNF - Konzentration zeigte eine signifikant negative Korrelation zum mittleren pulmonalen arteriellen Druck (mean pulmonary artery pressure; mPAP) sowie pulmonalarteriellen Widerstand (pulmonary vascular resistance; PVR), wobei niedrige BDNF - Plasmakonzentrationen mit einer schweren PH assoziiert werden konnten. Im Gesamtmodell zeigte sich daher nach Gruppierung der Patienten ein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen (Kontrollgruppe versus präkapillärer bzw. prä- / postkapillärer Gruppe).
Zusammenfassend:
1) BDNF erhöht die Proliferation von PASMC in vitro, wohingegen der BDNF spezifische - SMC Knockout dem durch chronische Hypoxie - induzierten Gefäßumbau im Hypoxiemodell in der Maus nicht entgegen wirken konnte. Vermutlich hat BDNF aus anderen Zellen die PASMC Proliferation beeinflusst.
2) Die BDNF - Defizienz ist protektiv gegenüber rechtsventrikulärer Dilatation, sowohl im chronischen Hypoxiemodell als auch im PAB - Modell, als Ursache kommen systemische Faktoren (veränderte Sympathikusaktivierung) in Betracht.
3) Erniedrigte BDNF - Plasmaspiegel in PH - Patienten korrelieren mit dem Schweregrad der PH. Weitere Experimente sind nötig, um die Rolle von BDNF im pulmonalen Gefäßumbau und Rechtsherzversagen sowie den Nutzen als potentiellen PH - Biomarker genauer zu definieren. Pulmonary hypertension (PH) is defined by elevation of pulmonary arterial pressure (mPAP) and pulmonary vascular resistance (PVR), with pre - capillary forms of PH also characterized by vascular remodeling of pulmonary vessels. Long lasting elevation of pulmonary pressure causes an increase in right ventricular (RV) afterload, which results in right heart hypertrophy and finally right heart failure. PH remains an incurable disease and available therapies can only delay the progression of PH. Currently, lung transplantation is the only therapeutic option for patients with severe PH.
The mechanisms underlying the pathognomonic vascular remodeling has not yet been fully elucidated. An imbalance between anti-apoptotic and pro-proliferative factors is suggested to play a key role in the development of pulmonary vascular remodeling in PH. Recent studies in the PH field, are focused on various growth factors, which activates tyrosine kinases. Elevated levels of a growth factor called brain - derived neurotrophic factor (BDNF), mostly known for its effect in the central nervous system where it regulates neuronal growth, differentiation and survival of neurons, were found in pulmonary vessels of PH patients. In addition, it has been shown that BDNF can be released from human pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) in vitro, and that this growth factor also regulates the PASMC proliferation. Against this background, the aim of this study was to clarify the role of BDNF in the pathogenesis of PH and right heart hypertrophy.
First, in vitro experiments were performed on isolated mouse PASMC. In the study, the pro-proliferative effect of BDNF found in human PASMC was confirmed in mouse PASMC. In addition, the mRNA expression of BDNF as well as high-affinity tyrosine kinase receptor (tyrosine kinase receptor B, TrkB) was found to be up - regulated in mouse PASMC after hypoxia exposure (1 % oxygen). The release of the BDNF protein was also significantly increased after hypoxia exposure, indicating that BDNF-TrkB signaling pathway is a possible key factor in the progression of vascular remodeling in PH.
Next, the role of the BDNF - TrkB signaling pathway was further evaluated in the hypoxic mouse model of PH by exposing mice to hypoxia (10 % O2) for four weeks. The chronic hypoxia mouse model of PH is known to be manifested by pathognomonic changes, similar to human PH. Since homozygous BDNF knockout is lethal, the smooth muscle cell (SMC) - specific BDNF knockout induced by tamoxifen was used. The hemodynamic parameters, right ventricular remodeling and pulmonary vascular remodeling were not significantly changed in the inducible SMC - specific BDNF knockout mice after four - week exposure to hypoxia, as compared to the non-BDNF - deficient control groups. Nevertheless, the SMC - specific BDNF knockout mice showed reduced right ventricular dilatation (RVID) and improved right ventricular systolic function (TAPSE), compared to the non - BDNF - deficient control groups after hypoxic exposure. All other echocardiographic parameters showed the same pattern in all genotypes. The obtained results indicate that the SMC - BDNF knockout has an impact on cardiac neural activity.
In order to examine the maximum effects of BDNF deficiency in the right heart, heterozygous BDNF knockout mice (BDNF+/-) and their littermates were subjected to pulmonary artery banding (PAB). Application of a metal clip around the pulmonary artery resulted in an increase in the right ventricle afterload, thus enabling the investigation of right heart hypertrophy independently of the pulmonary circulation as well as the hypoxic stimulus. The hemodynamic measurements showed that the morphological parameters of right heart hypertrophy and fibrosis in the right ventricle were not significantly different between the two experimental groups. In addition, there were no changes in mRNA expression level in the right ventricle of extracellular matrix proteins, such as collagen - 1, - 3, MMP - 2, and TIMP - 2, as well as the cardiac markers, ANP and BNP, between groups three weeks after PAB. However, BDNF+/- mice showed decreased right ventricular dilatation in echocardiographic follow - up three weeks after PAB surgery compared to wildtype controls, which is in line with the results obtained from the chronic hypoxia model.
In addition, plasma levels of BDNF were determined in PH and non - PH patients, and correlated with invasive hemodynamic parameters. The BDNF concentration showed a significant negative correlation with mPAP and PVR, indicating that low BDNF plasma concentrations could be associated with severe PH. In general, there was a significant difference between the analyzed groups of PH patients (control group versus pre - capillary or pre - / post - capillary group).
In conclusion:
1) BDNF increases PASMC proliferation in vitro, however, in vivo BDNF specific-SMC knockout did not counteract the chronic hypoxia - induced vascular remodeling in the mouse hypoxia model of PH. Presumably, BDNF released from other cell types might has an impact on the PASMC proliferation.
2) BDNF deficiency is protective against right ventricular dilatation in both chronic hypoxia and PAB model, suggesting the involvement of systemic factors (altered sympathetic activation).
3) The lower BDNF plasma level in PH patients correlates with the severity of the disease. Further studies are needed to define the role of BDNF in vascular remodeling and right heart failure as well as its relevance as a potential PH biomarker.
| Erscheinungsdatum | 10.07.2022 |
|---|---|
| Reihe/Serie | Edition Scientifique |
| Verlagsort | Gießen |
| Sprache | deutsch |
| Maße | 155 x 215 mm |
| Themenwelt | Veterinärmedizin ► Allgemein |
| Schlagworte | BDNF • Hypoxie • Pulmonale Hypertonie |
| ISBN-10 | 3-8359-7034-8 / 3835970348 |
| ISBN-13 | 978-3-8359-7034-2 / 9783835970342 |
| Zustand | Neuware |
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