Untersuchung der Wirkung von Perfluoroctansäure und Perfluoroctansulfonsäure auf die metabolische Signatur von AML12 Leberzellen
Seiten
2018
VVB Laufersweiler Verlag
978-3-8359-6657-4 (ISBN)
VVB Laufersweiler Verlag
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Umweltchemikalien können auf vielfältige Weise auf eine Zelle bzw. den Organismus von Mensch und Tier einwirken, d.h. genotoxische und nicht-genotoxische Effekte haben. Die Umsatzraten in den verschiedenen Stoffwechselwegen stellen das Endprodukt aller komplexen Regulationsmechanismen und Wechselwirkungen auf der Ebene der DNA, RNA, den Proteinen und Signalkaskaden dar. Die metabolische Signatur einer Zelle ist somit ein Spiegel der physiologischen Funktionen und des physiologischen Gesamtzustandes einer Zelle.
Perfluoroctansäure (PFOA) und Perfluoroctansulfonsäure (PFOS) gehören in die Gruppe der perfluorierten Alkylsubstanzen (PFAS), welche z.B. zur Imprägnierung von Textilien oder bei der Herstellung von Verpackungen für Lebensmittel verwendet werden. Durch das legale Verbringen von PFAS-haltigen Haushaltsprodukten auf die Mülldeponien können PFAS in das Oberflächen-, Grund- und Trinkwasser gelangen. Da PFAS chemisch sehr stabil und biologisch kaum abbaubar sind, können sie in der Umwelt und im Organismus von Mensch und Tier akkumulieren. Aufgrund der nachgewiesenen Anreicherung der PFAS in der Leber untersuchte die vorliegende Doktorarbeit den Effekt von PFOA und PFOS auf den Stoffwechsel der Leberzelllinie AML12. Dabei wurden zwei typische Stoffwechselsituationen des Organismus in Zellkultur simuliert: eine ausreichende Glucoseversorgung und Glucosemangel.
In Gegenwart von Glucose (Glycolyse-Bedingungen) führte der Zusatz von PFOA und PFOS in das Nährmedium der AML12 Zellen zu einer konzentrationsabhängigen, vollständigen Hemmung der Zellproliferation. PFOS zeigte dabei eine deutlich stärker hemmende Wirkung auf die Zellproliferation als PFOA. Durch Auszählen der lebenden Zellen/Well wurde für PFOA ein IC50 (Inhibition Concentration 50 %)-Wert von 387 µM und ein TGI (Total Growth Inhibition)-Wert von 600 µM ermittelt, während für PFOS der IC50-Wert bei 222 µM und der TGI-Wert bei 320 µM lag. Der parallel durchgeführte 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Test ergab sowohl für PFOA als auch für PFOS deutlich höhere IC50-Werte (PFOA: 480 µM, PFOS: 315 µM). Als eine Erklärung für die Diskrepanz zwischen den beiden Verfahren konnte erstmals in dieser Arbeit gezeigt werden, dass sowohl PFOA als auch PFOS die Dehydrogenaseaktivitäten, auf welchen der MTT-Test beruht, erhöhen. Da die Dehydrogenaseaktivitäten pro Kultivierungsplatte nicht mit der zugrundeliegenden Zellzahl korrelieren, wenn die Testsubstanzen die Dehydrogenaseaktivitäten wie im Fall von PFOA und PFOS verändern, sind die Ergebnisse der Zellzählung deutlich realistischer einzuschätzen als die Ergebnisse des MTT-Tests. Die Hemmung der Zellproliferation war selbst in den höchsten getesteten PFOA- bzw. PFOS-Konzentrationen (600 µM bzw. 320 µM) reversibel.
Im Hungerzustand ist die Leber für die Aufrechterhaltung der Glucose-Spiegel im Blut verantwortlich. Unter Gluconeogenese-Bedingungen zeigte PFOS im Vergleich zu den Glycolyse-Bedingungen eine deutlich cytotoxischere Wirkung auf die AML12 Zellen. PFOA wies diesen Unterschied nicht auf (LC50-Werte PFOA: 797 µM, PFOS: 144 µM).
Die in der vorliegenden Arbeit eingesetzte niedrigste Konzentration von PFOA (12 µM) bzw. PFOS (10 µM) entspricht in etwa den Höchstkonzentrationen, welche in Lebern von Tieren detektiert wurden. Bereits diese niedrigsten getesteten Konzentrationen von PFOA und PFOS führten zu vereinzelten Veränderungen im Stoffwechsel der Zellen. Hierzu zählten Veränderungen der Lactat-, Glutamat- und Harnstoffproduktion und des CTP-Spiegels unter Glykolysebedingungen sowie des Lactat-Verbrauchs unter Gluconeogenesebedingungen. In der 50-fach höheren Konzentration im Fall von PFOA und in der 32-fach höheren Konzentration im Fall von PFOS stellten sich bei Kultivierung der Zellen unter Glycolyse-Bedingungen Veränderungen im Stoffwechsel ein, welche vor allem den Kohlenhydrat- und Aminosäure-Stoffwechsel betrafen.
Die Stoffwechseluntersuchungen unter Glycolyse-Bedingungen ergaben in den PFOA-gehemmten Zellen (600 µM) eine Reduzierung im Glutamin-Verbrauch und eine Zunahme im Glucose-Verbrauch sowie der Lactat-, Glutamat- und Serin-Produktion. Bei den PFOS-gehemmten Zellen wurde der Glutamin-Verbrauch sowie die Lactat- und Glutamat-Produktion reduziert. Der Glucose-Verbrauch blieb unbeeinflusst, während der Serin-Verbrauch zunahm. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass sowohl PFOA als auch PFOS in hohen Konzentrationen (600 µM bzw. 320 µM) die Glutaminolyse hemmten. Die verstärkte Glycolyse in den PFOA-gehemmten Zellen und die vermehrte Serinolyse in den PFOS-gehemmten Zellen könnte eine mögliche Erklärung dafür sein, dass der Energiestatus gemessen als ((ATP + 0,5 ADP)/(ATP+ADP+AMP)) in den PFOA- und PFOS-behandelten Zellen nicht verändert war.
Der gleichzeitig festgestellte Anstieg der Purine (ATP+GTP) im Verhältnis zu den Pyrimidinen (UTP+CTP) korreliert mit der reduzierten Zellproliferation in den PFOA- bzw. PFOS-gehemmten Zellen. Die Zunahme der UDPGlcNAc-Spiegel und der gleichzeitig tendenzielle Abfall der UTP-Spiegel weisen darauf hin, dass UTP in die Synthese von Aminozuckern eingeschleust wurde. N-Acetylaminozucker werden für die Bildung von Glycoproteinen und Glycolipiden verwendet.
Bei hohen Blutglucosespiegeln speichert die Leber einen Teil der Glucose als Glykogen. In den TGI-Konzentrationen wurde sowohl durch PFOA als auch PFOS die Speicherung komplett unterdrückt.
Im Lipid-Stoffwechsel konnte bei den gemessenen Parametern (Triglyceride, Cholesterin) keine Veränderungen durch PFOA bzw. PFOS beobachtet werden.
Eine wichtige Aufgabe der Leber ist die Entgiftung von Ammoniumionen zu Harnstoff. Die Harnstoffproduktion war bei den PFOA-behandelten Zellen in der höchsten getesteten Konzentration von 600 µM PFOA komplett gehemmt. PFOS zeigte in der niedrigsten Konzentration von 10 µM einen Anstieg in der Harnstoffabgabe. Höhere PFOS-Konzentrationen hatten keinen Einfluss auf die Harnstoffproduktion im Vergleich zu den Kontrollzellen.
Unter Gluconeogenese-Bedingungen wurde von den im Nährmedium angebotenen Gluconeogenese-Substraten Lactat, Pyruvat, Glutamin und Serin in den PFOA-behandelten Zellen in der höchsten getesteten Konzentration von 600 µM signifikant vermehrt Glutamin, Pyruvat und Serin umgesetzt. Die PFOS-behandelten Zellen steigerten im Wesentlichen die Aufnahme von Lactat bei der höchsten eingesetzten Konzentration von 50 µM. Eine abschließende Beurteilung, inwieweit die Ausgangssubstrate in den AML12 Zellen unter Gluconeogenese-Bedingungen bis zum Produkt Glucose umgesetzt werden, ist bei der in der vorliegenden Arbeit verwendeten AML12 Zelllinie nicht möglich, da diese durch eine sehr niedrige Glucoseabgabe unter Gluconeogenese-Bedingungen charakterisiert ist.
In Hungersituationen bildet die Leber aus dem anfallenden Acetyl-CoA Ketonkörper. Weder auf die intrazellulären Ketonkörperkonzentrationen noch auf die Abgabe von Ketonkörpern hatten PFOA und PFOS in den getesteten Konzentrationen einen Einfluss.
Zusammenfassend zeigte PFOS im Vergleich zu PFOA schon bei deutlich niedrigeren Konzentrationen einen Effekt auf die Zellproliferation, metabolische Aktivität, Glycolyse, Glutaminolyse, Serinolyse, Harnstoffproduktion, Glykogenspeicherung und den Nukleotid-Stoffwechsel der AML12 Zellen.
Perfluoroctansäure (PFOA) und Perfluoroctansulfonsäure (PFOS) gehören in die Gruppe der perfluorierten Alkylsubstanzen (PFAS), welche z.B. zur Imprägnierung von Textilien oder bei der Herstellung von Verpackungen für Lebensmittel verwendet werden. Durch das legale Verbringen von PFAS-haltigen Haushaltsprodukten auf die Mülldeponien können PFAS in das Oberflächen-, Grund- und Trinkwasser gelangen. Da PFAS chemisch sehr stabil und biologisch kaum abbaubar sind, können sie in der Umwelt und im Organismus von Mensch und Tier akkumulieren. Aufgrund der nachgewiesenen Anreicherung der PFAS in der Leber untersuchte die vorliegende Doktorarbeit den Effekt von PFOA und PFOS auf den Stoffwechsel der Leberzelllinie AML12. Dabei wurden zwei typische Stoffwechselsituationen des Organismus in Zellkultur simuliert: eine ausreichende Glucoseversorgung und Glucosemangel.
In Gegenwart von Glucose (Glycolyse-Bedingungen) führte der Zusatz von PFOA und PFOS in das Nährmedium der AML12 Zellen zu einer konzentrationsabhängigen, vollständigen Hemmung der Zellproliferation. PFOS zeigte dabei eine deutlich stärker hemmende Wirkung auf die Zellproliferation als PFOA. Durch Auszählen der lebenden Zellen/Well wurde für PFOA ein IC50 (Inhibition Concentration 50 %)-Wert von 387 µM und ein TGI (Total Growth Inhibition)-Wert von 600 µM ermittelt, während für PFOS der IC50-Wert bei 222 µM und der TGI-Wert bei 320 µM lag. Der parallel durchgeführte 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Test ergab sowohl für PFOA als auch für PFOS deutlich höhere IC50-Werte (PFOA: 480 µM, PFOS: 315 µM). Als eine Erklärung für die Diskrepanz zwischen den beiden Verfahren konnte erstmals in dieser Arbeit gezeigt werden, dass sowohl PFOA als auch PFOS die Dehydrogenaseaktivitäten, auf welchen der MTT-Test beruht, erhöhen. Da die Dehydrogenaseaktivitäten pro Kultivierungsplatte nicht mit der zugrundeliegenden Zellzahl korrelieren, wenn die Testsubstanzen die Dehydrogenaseaktivitäten wie im Fall von PFOA und PFOS verändern, sind die Ergebnisse der Zellzählung deutlich realistischer einzuschätzen als die Ergebnisse des MTT-Tests. Die Hemmung der Zellproliferation war selbst in den höchsten getesteten PFOA- bzw. PFOS-Konzentrationen (600 µM bzw. 320 µM) reversibel.
Im Hungerzustand ist die Leber für die Aufrechterhaltung der Glucose-Spiegel im Blut verantwortlich. Unter Gluconeogenese-Bedingungen zeigte PFOS im Vergleich zu den Glycolyse-Bedingungen eine deutlich cytotoxischere Wirkung auf die AML12 Zellen. PFOA wies diesen Unterschied nicht auf (LC50-Werte PFOA: 797 µM, PFOS: 144 µM).
Die in der vorliegenden Arbeit eingesetzte niedrigste Konzentration von PFOA (12 µM) bzw. PFOS (10 µM) entspricht in etwa den Höchstkonzentrationen, welche in Lebern von Tieren detektiert wurden. Bereits diese niedrigsten getesteten Konzentrationen von PFOA und PFOS führten zu vereinzelten Veränderungen im Stoffwechsel der Zellen. Hierzu zählten Veränderungen der Lactat-, Glutamat- und Harnstoffproduktion und des CTP-Spiegels unter Glykolysebedingungen sowie des Lactat-Verbrauchs unter Gluconeogenesebedingungen. In der 50-fach höheren Konzentration im Fall von PFOA und in der 32-fach höheren Konzentration im Fall von PFOS stellten sich bei Kultivierung der Zellen unter Glycolyse-Bedingungen Veränderungen im Stoffwechsel ein, welche vor allem den Kohlenhydrat- und Aminosäure-Stoffwechsel betrafen.
Die Stoffwechseluntersuchungen unter Glycolyse-Bedingungen ergaben in den PFOA-gehemmten Zellen (600 µM) eine Reduzierung im Glutamin-Verbrauch und eine Zunahme im Glucose-Verbrauch sowie der Lactat-, Glutamat- und Serin-Produktion. Bei den PFOS-gehemmten Zellen wurde der Glutamin-Verbrauch sowie die Lactat- und Glutamat-Produktion reduziert. Der Glucose-Verbrauch blieb unbeeinflusst, während der Serin-Verbrauch zunahm. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass sowohl PFOA als auch PFOS in hohen Konzentrationen (600 µM bzw. 320 µM) die Glutaminolyse hemmten. Die verstärkte Glycolyse in den PFOA-gehemmten Zellen und die vermehrte Serinolyse in den PFOS-gehemmten Zellen könnte eine mögliche Erklärung dafür sein, dass der Energiestatus gemessen als ((ATP + 0,5 ADP)/(ATP+ADP+AMP)) in den PFOA- und PFOS-behandelten Zellen nicht verändert war.
Der gleichzeitig festgestellte Anstieg der Purine (ATP+GTP) im Verhältnis zu den Pyrimidinen (UTP+CTP) korreliert mit der reduzierten Zellproliferation in den PFOA- bzw. PFOS-gehemmten Zellen. Die Zunahme der UDPGlcNAc-Spiegel und der gleichzeitig tendenzielle Abfall der UTP-Spiegel weisen darauf hin, dass UTP in die Synthese von Aminozuckern eingeschleust wurde. N-Acetylaminozucker werden für die Bildung von Glycoproteinen und Glycolipiden verwendet.
Bei hohen Blutglucosespiegeln speichert die Leber einen Teil der Glucose als Glykogen. In den TGI-Konzentrationen wurde sowohl durch PFOA als auch PFOS die Speicherung komplett unterdrückt.
Im Lipid-Stoffwechsel konnte bei den gemessenen Parametern (Triglyceride, Cholesterin) keine Veränderungen durch PFOA bzw. PFOS beobachtet werden.
Eine wichtige Aufgabe der Leber ist die Entgiftung von Ammoniumionen zu Harnstoff. Die Harnstoffproduktion war bei den PFOA-behandelten Zellen in der höchsten getesteten Konzentration von 600 µM PFOA komplett gehemmt. PFOS zeigte in der niedrigsten Konzentration von 10 µM einen Anstieg in der Harnstoffabgabe. Höhere PFOS-Konzentrationen hatten keinen Einfluss auf die Harnstoffproduktion im Vergleich zu den Kontrollzellen.
Unter Gluconeogenese-Bedingungen wurde von den im Nährmedium angebotenen Gluconeogenese-Substraten Lactat, Pyruvat, Glutamin und Serin in den PFOA-behandelten Zellen in der höchsten getesteten Konzentration von 600 µM signifikant vermehrt Glutamin, Pyruvat und Serin umgesetzt. Die PFOS-behandelten Zellen steigerten im Wesentlichen die Aufnahme von Lactat bei der höchsten eingesetzten Konzentration von 50 µM. Eine abschließende Beurteilung, inwieweit die Ausgangssubstrate in den AML12 Zellen unter Gluconeogenese-Bedingungen bis zum Produkt Glucose umgesetzt werden, ist bei der in der vorliegenden Arbeit verwendeten AML12 Zelllinie nicht möglich, da diese durch eine sehr niedrige Glucoseabgabe unter Gluconeogenese-Bedingungen charakterisiert ist.
In Hungersituationen bildet die Leber aus dem anfallenden Acetyl-CoA Ketonkörper. Weder auf die intrazellulären Ketonkörperkonzentrationen noch auf die Abgabe von Ketonkörpern hatten PFOA und PFOS in den getesteten Konzentrationen einen Einfluss.
Zusammenfassend zeigte PFOS im Vergleich zu PFOA schon bei deutlich niedrigeren Konzentrationen einen Effekt auf die Zellproliferation, metabolische Aktivität, Glycolyse, Glutaminolyse, Serinolyse, Harnstoffproduktion, Glykogenspeicherung und den Nukleotid-Stoffwechsel der AML12 Zellen.
| Erscheinungsdatum | 05.03.2018 |
|---|---|
| Reihe/Serie | Edition Scientifique |
| Sprache | deutsch |
| Maße | 146 x 210 mm |
| Gewicht | 400 g |
| Themenwelt | Veterinärmedizin |
| Schlagworte | Doktorarbeit • Uni • Wissenschaft |
| ISBN-10 | 3-8359-6657-X / 383596657X |
| ISBN-13 | 978-3-8359-6657-4 / 9783835966574 |
| Zustand | Neuware |
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