Vergleichende Untersuchungen zur Speziesdifferenzierung und –identifizierung von Cronobacter-Isolaten verschiedener Herkunft
Seiten
2017
VVB Laufersweiler Verlag
978-3-8359-6598-0 (ISBN)
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Cronobacter spp. (früher Enterobacter sakazakii) sind fakultativ anaerobe, peritrich begeißelte, gramnegative Stäbchenbakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae. Sie sind opportunistische Erreger, die vor allem bei Neugeborenen und Säuglingen, aber auch bei immungeschwächten und älteren Patienten schwere Allgemeinerkrankungen hervorrufen können. Klinische Bilder von Cronobacter spp.-Infektionen manifestieren sich u.a. in Meningitiden, nekrotisierenden Enterokolitiden und Septikämien.
Die wichtigste Infektionsquelle für die Erkrankungen bei Säuglingen stellt kontaminierte pulverförmige Säuglingsnahrung dar (FAO/WHO, 2004; FRIEDEMANN, 2008). Deshalb sind Cronobacter spp. laut der Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 der Kommission vom 15. November 2005 über mikrobiologische Kriterien für Lebensmittel, geändert durch die Verordnungen (EG) Nr. 1441/2007 und Nr. 365/2010, als Lebensmittelsicherheitskriterium definiert.
Neben pulverförmiger Säuglingsnahrung wurden Cronobacter spp. bisher aus einer großen Zahl von Lebensmitteln pflanzlicher und tierischer Herkunft isoliert. Aber auch in verschiedenen Umweltproben, wie aus Staubsaugerbeutelinhalten privater Haushalte oder aus dem Produktionsumfeld lebensmittelherstellender Fabriken, konnten Cronobacter spp. nachgewiesen werden.
Aufgrund neuer genetischer und biochemischer Erkenntnisse wurde die ehemalige Spezies Enterobacter sakazakii taxonomisch durch die neue Gattung Cronobacter reklassifiziert (IVERSEN et al., 2008). Mittlerweile hat sich diese Taxonomie vorläufig etabliert und die neue Gattung Cronobacter enthält derzeit (Juni 2017) sieben Spezies: Cronobacter (C.) sakazakii, C. malonaticus, C. turicensis, C. muytjensii, C. dublinensis mit drei Subspezies (C. dublinensis subsp. dublinensis, C. dublinensis subsp. lausannensis, C. dublinensis subsp. lactaridi), C. condimenti und C. universalis (IVERSEN et al., 2008; JOSEPH et al., 2012a).
Im Hinblick auf die Überwachung und Prävention lebensmittelbedingter Erkrankungen, verursacht durch Cronobacter spp., ist eine schnelle und sichere Identifizierung essentiell. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Variabilität und relative Häufigkeit verschiedener Cronobacter-Spezies in Säuglingsnahrungsmitteln sowie einigen anderen Lebensmitteln des deutschen Marktes und des Produktionsumfeldes von Säuglingsnahrung herstellenden Betrieben zu bestimmen. Zudem sollten die verschiedenen Differenzierungsmöglichkeiten untereinander verglichen und auf ihre Routinetauglichkeit getestet werden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden am Institut für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde, Professur für Milchwissenschaften der Justus-Liebig-Universität Gießen, insgesamt 259 Cronobacter-Isolate aus unterschiedlicher Herkunft mit unterschiedlichen Methoden analysiert.
Mittels MALDI-TOF MS konnten alle Isolate auf Genusebene als Cronobacter spp. identifiziert werden.
Anhand von verschiedenen biochemischen Reaktionen konnten insgesamt 82,2% (213 von 259) der Isolate als Spezies C. sakazakii identifiziert werden. Dabei handelte es sich bei der Mehrzahl der Isolate um Biotyp 1 (39,8%) und Biotyp 2 (37,0%). Es folgten mit abnehmender Häufigkeit die Biotypen 8a (1,9%), 8 (0,8%) und 13 (0,8%). Fünf der als
C. sakazakii identifizierten Isolate (1,9%) konnten keinem Biotyp eindeutig zugeordnet werden. Als zweithäufigste Spezies mit einem Anteil von 13,9% (36 von 259) der Isolate war C. malonaticus mit den Biotypen 5 (10,0%) und 9 (3,9%) vertreten. Neun Isolate (3,5%) wurden als C. turicensis (Biotyp 16) identifiziert, ein Isolat (0,4%) erwies sich als C. muytjensii (Biotyp 15).
Neben der biochemischen Charakterisierung wurden alle Isolate mit einer Spezies spezifischen PCR, basierend auf dem rpoB-Gen, untersucht. Dabei wurden insgesamt 83,8% (n=217) der Isolate als C. sakazakii, 12,7% (n=33) als C. malonaticus, 3,1% (n=8) als C. turicensis und 0,4% (n=1) als C. muytjensii identifiziert.
Die Amplifizierung des Spezies-spezifischen Bereiches des rpoB-Gens lieferte bei 88,8% (n=230) der Isolate übereinstimmende Ergebnisse mit denen der biochemischen Untersuchung. 11,2% (n=29) der Isolate konnten nicht durch die Spezies-spezifische PCR identifiziert werden. Die häufigsten Unterschiede wurden für die genetisch eng verwandten Spezies C. sakazakii und C. malonaticus festgestellt. Ausgewählte Isolate (n=26) wurden mittels partieller rpoB-Gen-Sequenzanalyse untersucht und mit zwölf Cronobacter Typstämmen der NCBI-Datenbank für Cronobacter verglichen. Allerdings traten auch hier Differenzierungsprobleme für die genetisch eng verwandten Spezies C. sakazakii und C. malonaticus auf, sodass keine eindeutige Identifizierung möglich war.
Mittels MLST wurden 14 Isolate untersucht. Bis auf drei Isolate konnten alle einem Sequenztyp und somit einer Spezies eindeutig zugeordnet werden. Die MLST bestätigte die Speziesidentität von zehn Isolaten in Übereinstimmung mit den Ergebnissen der biochemischen Untersuchung. Vier Isolate konnten nicht bestätigt werden. Insgesamt wurden elf verschiedene Sequenztypen (STs) nachgewiesen. Darunter befanden sich sieben STs, die erstmals im Rahmen dieser Studie beschrieben wurden. Ein Isolat aus Säuglingsnahrung wurde als C. sakazakii ST4 identifiziert.
Zur Darstellung der klonalen Beziehungen zwischen den verschiedenen Isolaten wurden 135 Isolate mittels Makrorestriktionsanalyse untersucht. Bei den untersuchten Isolaten handelte es sich um die Spezies C. sakazakii (n=105), C. malonaticus (n=23) und
C. turicensis (n=7). Insgesamt konnten 99 verschiedene PFGE-Typen unterschieden und eine große genetische Vielfalt bei den Spezies C. sakazakii, C. malonaticus und
C. turicensis dargestellt werden.
Zusammenfassend kamen die Spezies C. sakazakii und C. malonaticus überwiegend in Säuglingsnahrungsmitteln vor, während C. turicensis nur in pflanzlichen Lebensmitteln nachgewiesen wurde. Ein Isolat erwies sich als C. muytjensii, dieses stammte aus einer Eiernudelprobe mit Basilikum.
Wie die im Rahmen der vorliegenden Arbeit ermittelten Ergebnisse zeigen, stellt
C. sakazakii die vorherrschende Spezies innerhalb der untersuchten Proben dar.
Durch die taxonomische Klassifizierung von Cronobacter spp. ist die Routinediagnostik nach wie vor mit einem erheblichen Nachweis- und Differenzierungsaufwand verbunden. Hinsichtlich der Speziesdifferenzierung, besonders zwischen den Spezies C. sakazakii und C. malonaticus, besteht weiterhin Bedarf an einer einfachen, zuverlässigen und kostengünstigen Methode. Solange keine Hinweise auf Unterschiede bezüglich der pathogenen Eigenschaften zwischen den Spezies existieren, ist eine Speziesdifferenzierung von Cronobacter spp. unter praktischen und rechtlichen Gesichtspunkten in der Routineuntersuchung derzeit noch nicht erforderlich. Im Hinblick auf die wissenschaftliche Charakterisierung der Gattung Cronobacter scheint eine Kombination mehrerer Methoden unverzichtbar.
Die wichtigste Infektionsquelle für die Erkrankungen bei Säuglingen stellt kontaminierte pulverförmige Säuglingsnahrung dar (FAO/WHO, 2004; FRIEDEMANN, 2008). Deshalb sind Cronobacter spp. laut der Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 der Kommission vom 15. November 2005 über mikrobiologische Kriterien für Lebensmittel, geändert durch die Verordnungen (EG) Nr. 1441/2007 und Nr. 365/2010, als Lebensmittelsicherheitskriterium definiert.
Neben pulverförmiger Säuglingsnahrung wurden Cronobacter spp. bisher aus einer großen Zahl von Lebensmitteln pflanzlicher und tierischer Herkunft isoliert. Aber auch in verschiedenen Umweltproben, wie aus Staubsaugerbeutelinhalten privater Haushalte oder aus dem Produktionsumfeld lebensmittelherstellender Fabriken, konnten Cronobacter spp. nachgewiesen werden.
Aufgrund neuer genetischer und biochemischer Erkenntnisse wurde die ehemalige Spezies Enterobacter sakazakii taxonomisch durch die neue Gattung Cronobacter reklassifiziert (IVERSEN et al., 2008). Mittlerweile hat sich diese Taxonomie vorläufig etabliert und die neue Gattung Cronobacter enthält derzeit (Juni 2017) sieben Spezies: Cronobacter (C.) sakazakii, C. malonaticus, C. turicensis, C. muytjensii, C. dublinensis mit drei Subspezies (C. dublinensis subsp. dublinensis, C. dublinensis subsp. lausannensis, C. dublinensis subsp. lactaridi), C. condimenti und C. universalis (IVERSEN et al., 2008; JOSEPH et al., 2012a).
Im Hinblick auf die Überwachung und Prävention lebensmittelbedingter Erkrankungen, verursacht durch Cronobacter spp., ist eine schnelle und sichere Identifizierung essentiell. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Variabilität und relative Häufigkeit verschiedener Cronobacter-Spezies in Säuglingsnahrungsmitteln sowie einigen anderen Lebensmitteln des deutschen Marktes und des Produktionsumfeldes von Säuglingsnahrung herstellenden Betrieben zu bestimmen. Zudem sollten die verschiedenen Differenzierungsmöglichkeiten untereinander verglichen und auf ihre Routinetauglichkeit getestet werden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden am Institut für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde, Professur für Milchwissenschaften der Justus-Liebig-Universität Gießen, insgesamt 259 Cronobacter-Isolate aus unterschiedlicher Herkunft mit unterschiedlichen Methoden analysiert.
Mittels MALDI-TOF MS konnten alle Isolate auf Genusebene als Cronobacter spp. identifiziert werden.
Anhand von verschiedenen biochemischen Reaktionen konnten insgesamt 82,2% (213 von 259) der Isolate als Spezies C. sakazakii identifiziert werden. Dabei handelte es sich bei der Mehrzahl der Isolate um Biotyp 1 (39,8%) und Biotyp 2 (37,0%). Es folgten mit abnehmender Häufigkeit die Biotypen 8a (1,9%), 8 (0,8%) und 13 (0,8%). Fünf der als
C. sakazakii identifizierten Isolate (1,9%) konnten keinem Biotyp eindeutig zugeordnet werden. Als zweithäufigste Spezies mit einem Anteil von 13,9% (36 von 259) der Isolate war C. malonaticus mit den Biotypen 5 (10,0%) und 9 (3,9%) vertreten. Neun Isolate (3,5%) wurden als C. turicensis (Biotyp 16) identifiziert, ein Isolat (0,4%) erwies sich als C. muytjensii (Biotyp 15).
Neben der biochemischen Charakterisierung wurden alle Isolate mit einer Spezies spezifischen PCR, basierend auf dem rpoB-Gen, untersucht. Dabei wurden insgesamt 83,8% (n=217) der Isolate als C. sakazakii, 12,7% (n=33) als C. malonaticus, 3,1% (n=8) als C. turicensis und 0,4% (n=1) als C. muytjensii identifiziert.
Die Amplifizierung des Spezies-spezifischen Bereiches des rpoB-Gens lieferte bei 88,8% (n=230) der Isolate übereinstimmende Ergebnisse mit denen der biochemischen Untersuchung. 11,2% (n=29) der Isolate konnten nicht durch die Spezies-spezifische PCR identifiziert werden. Die häufigsten Unterschiede wurden für die genetisch eng verwandten Spezies C. sakazakii und C. malonaticus festgestellt. Ausgewählte Isolate (n=26) wurden mittels partieller rpoB-Gen-Sequenzanalyse untersucht und mit zwölf Cronobacter Typstämmen der NCBI-Datenbank für Cronobacter verglichen. Allerdings traten auch hier Differenzierungsprobleme für die genetisch eng verwandten Spezies C. sakazakii und C. malonaticus auf, sodass keine eindeutige Identifizierung möglich war.
Mittels MLST wurden 14 Isolate untersucht. Bis auf drei Isolate konnten alle einem Sequenztyp und somit einer Spezies eindeutig zugeordnet werden. Die MLST bestätigte die Speziesidentität von zehn Isolaten in Übereinstimmung mit den Ergebnissen der biochemischen Untersuchung. Vier Isolate konnten nicht bestätigt werden. Insgesamt wurden elf verschiedene Sequenztypen (STs) nachgewiesen. Darunter befanden sich sieben STs, die erstmals im Rahmen dieser Studie beschrieben wurden. Ein Isolat aus Säuglingsnahrung wurde als C. sakazakii ST4 identifiziert.
Zur Darstellung der klonalen Beziehungen zwischen den verschiedenen Isolaten wurden 135 Isolate mittels Makrorestriktionsanalyse untersucht. Bei den untersuchten Isolaten handelte es sich um die Spezies C. sakazakii (n=105), C. malonaticus (n=23) und
C. turicensis (n=7). Insgesamt konnten 99 verschiedene PFGE-Typen unterschieden und eine große genetische Vielfalt bei den Spezies C. sakazakii, C. malonaticus und
C. turicensis dargestellt werden.
Zusammenfassend kamen die Spezies C. sakazakii und C. malonaticus überwiegend in Säuglingsnahrungsmitteln vor, während C. turicensis nur in pflanzlichen Lebensmitteln nachgewiesen wurde. Ein Isolat erwies sich als C. muytjensii, dieses stammte aus einer Eiernudelprobe mit Basilikum.
Wie die im Rahmen der vorliegenden Arbeit ermittelten Ergebnisse zeigen, stellt
C. sakazakii die vorherrschende Spezies innerhalb der untersuchten Proben dar.
Durch die taxonomische Klassifizierung von Cronobacter spp. ist die Routinediagnostik nach wie vor mit einem erheblichen Nachweis- und Differenzierungsaufwand verbunden. Hinsichtlich der Speziesdifferenzierung, besonders zwischen den Spezies C. sakazakii und C. malonaticus, besteht weiterhin Bedarf an einer einfachen, zuverlässigen und kostengünstigen Methode. Solange keine Hinweise auf Unterschiede bezüglich der pathogenen Eigenschaften zwischen den Spezies existieren, ist eine Speziesdifferenzierung von Cronobacter spp. unter praktischen und rechtlichen Gesichtspunkten in der Routineuntersuchung derzeit noch nicht erforderlich. Im Hinblick auf die wissenschaftliche Charakterisierung der Gattung Cronobacter scheint eine Kombination mehrerer Methoden unverzichtbar.
| Erscheinungsdatum | 04.08.2017 |
|---|---|
| Reihe/Serie | Edition Scientifique |
| Sprache | deutsch |
| Maße | 146 x 210 mm |
| Gewicht | 210 g |
| Einbandart | Paperback |
| Themenwelt | Veterinärmedizin |
| Schlagworte | Doktorarbeit • Uni • Wissenschaft |
| ISBN-10 | 3-8359-6598-0 / 3835965980 |
| ISBN-13 | 978-3-8359-6598-0 / 9783835965980 |
| Zustand | Neuware |
| Haben Sie eine Frage zum Produkt? |
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