Zelluläre Charakterisierung des Renin-Angiotensin Systems sowie des Glutamatsystems im hypothalamischen Subfornikal- und Subseptalorgan
Seiten
2019
VVB Laufersweiler Verlag
978-3-8359-6804-2 (ISBN)
VVB Laufersweiler Verlag
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Das in der Lamina terminalis des rostralen Hypothalamus in unmittelbarer Nähe zum dritten Hirnventrikel gelegene Organum subfornicale (SFO) der Ratte repräsentiert ebenso wie das analoge Organum subseptale (SSO) des Huhnes eines der senso-rischen zirkumventrikulären Organe (CVOs) des Gehirns. Aufgrund ihrer Lage, der hohen Dichte fenestrierter Kapillaren und dem Vorhandensein zahlreicher parvozel-lullärer Neurone spielen sowohl das SFO als auch das SSO eine entscheidende Rolle als sensorische neuro-gliale Messfühler u.a. im Rahmen der zentralnervösen Regulation des Salz- und Wasserhaushaltes sowie des Kreislaufsystems. Neurone und auch gliale Zellen beider CVOs sind dabei in der Lage, aufgrund der durchlässi-gen endothelialen Blut-Hirn Schranke im Blut zirkulierende Signalmoleküle wie An-giotensin II (ANG II) oder Elektrolyte zu detektieren. Basierend auf den reziproken neuronalen Verbindungen zu über- bzw. nachgeordneten (extra-)hypothalamischen Hirnstrukturen kommt es zu einer finalen Induktion von Trinkwasseraufnahme, peri-pherer Vasokonstriktion, renaler Natrium- und Wasserretention sowie Sympathikus-aktivierung. Für die sensorischen Funktionen des SFOs der Ratte respektive des SSOs des Huhnes gibt es in der Fachliteratur der letzten 40 Jahre zahlreiche Hin-weise darauf, dass dabei sowohl das zirkulierende Renin-Angiotensin System (RAS) mit seinem finalen Peptidhormon ANG II eine entscheidende Rolle spielt als auch ein postuliertes SFO- bzw. SSO-intrinsisches RAS von Bedeutung sein könnte. Wei-terhin könnte dem im ZNS wichtigsten exzitatorischen Neurotransmitter Glutamat (GLUT) durch Aktivierung iono- und metabotroper Rezeptorproteine im SFO der Ratte eine entscheidende Rolle im Rahmen der neuronalen Integration perzipierter afferenter Informationen zukommen. Ziel der hier vorliegenden Promotionsarbeit war es daher, einerseits die Expression einzelner Komponenten eines SFO- bzw. SSO-intrinsischen RAS in der Primärzellkultur zu identifizieren sowie die funktionale bio-logische Aktivität der Schlüsselenzyme nachzuweisen. Für das glutamaterge System sollte andererseits die funktionale Expression metabotroper und ionotroper Rezep-toren in Zellen der SFO-spezifischen Primärzellkultur charakterisiert werden.
Zur Charakterisierung eines SFO-intrinsischen RAS wurde eine neuro-gliale Primär-zellkultur dieses sensorischen CVOs aus dem Gehirn neonataler Ratten etabliert und nach vier- bis fünftägiger Kultivierung, welche der Differenzierung der Zellen diente, für in vitro Studien herangezogen. Mittels immunzytochemischer Untersuchungen unter Einsatz spezifischer Antikörper / -seren gegen einzelne Komponenten des RAS wurde die Expression des Präkursorproteins Angiotensinogen (Aogen) aus-schließlich in Vimentin-immunopositiven Zellen nachgewiesen, bei denen es sich vermutlich um Tanyzyten und / oder Astrozytenvorläuferzellen handelte. Das erst 2006 entdeckte Präkursorpeptid Angiotensin (1-12) (ANG (1-12)) wurde in SFO-intrinsischen Neuronen, und ANG II als aktive Komponente des SFO-intrinsischen RAS in perinukleären Vesikeln differenzierter Astrozyten detektiert. Des Weiteren konnte die Expression des angiotensin-converting enzyme (ACE), welches das Prä-kursorpeptid Angiotensin I (ANG I) zu ANG II konvertiert, in Neuronen, Astrozyten-vorläuferzellen und differenzierten Astrozyten verifiziert werden. Die quantitative Er-fassung der mRNA Expression für rattenspezifische(s) Aogen, Renin, ACE, Cathep-sin D und Chymasen in der SFO-spezifischen Zellkultur mittels real-time PCR ergab hohe Expressionsraten für Aogen, ACE und Cathepsin D, wohingegen Renin und Chymasen niedrige Expressionsraten zeigten. Dies stellt eine Bestätigung der im-munzytochemischen Analysen zum Nachweis der SFO-intrinsischen Biosynthese einzelner Komponenten des RAS dar.
Zahlreiche Calcium-Imaging Experimente in der SFO-spezifischen neuro-glialen Pri-märzellkultur dienten der funktionalen Expressionsanalyse wichtiger Schlüsselen-zyme (Renin, ACE, Cathepsine, Chymasen) für die SFO-intrinsische Generierung des bioaktiven Neuropeptids ANG II. So induzierte die Superfusionsstimulation der SFO-spezifischen Primärzellkultur mit Aogen, ANG (1-12) bzw. ANG I im Rahmen der Signaltransduktion – hinsichtlich ihrer Amplitude quantifizierbare – transiente in-trazelluläre Calciumsignale der Fura-2 beladenen Neurone und Astrozyten. Der Ein-satz spezifischer Inhibitoren für Renin [Aogen ANG I], ACE [ANG (1-12) bzw. ANG I ANG II] sowie Cathepsine und Chymasen [Aogen bzw. ANG (1-12) ANG II] bewirkte eine partielle bis vollständige Inhibition der durch Superfusion der Primär-kulturen mit Aogen, ANG (1-12) oder ANG I induzierten Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration ([Ca2+]iz) in quantitativ erfassten und statistisch analysierten Zellpopulationen. Dementsprechend konnte mittels Calcium-Imaging Methodik die funktionale Expression von Renin, ACE sowie Cathepsin D bzw. Chymasen in der SFO-spezifischen Primärkultur demonstriert werden.
Die mittels Immunzytochemie (ACE) und real-time PCR (Renin, ACE, Cathepsin D, Chymasen) nachgewiesene Expression enzymatischer RAS-Komponenten konnte durch die funktioalen Analysen in der Primärzellkultur bestätigt werden. Für die partielle, experimentelle Charakterisierung des vogelspezifischen SSO-intrin-sischen RAS erfolgte zunächst die de novo Etablierung einer neuro-glialen Primär-zellkultur dieses sensorischen CVOs aus dem Gehirn von Eintaggsküken, basierend auf der Optimierung der Präparationstechnik. Nach vier- bis fünftägiger Kultivierung konnten Neurone, Astrozyten und Mikrogliazellen durch den immunzytochemischen Nachweis zelltypspezifischer Markerproteine identifiziert und quantitativ erfasst wer-den. In ersten Calcium-Imaging Experimenten an Fura-2 beladenen Neuronen und Astrozyten wurde erfolgreich eine Dosis-Wirkungs-Beziehung für die durch ANG II induzierten intrazellulären Calciumsignale erstellt. Die offensichtliche Existenz eines ANG II spezifischen Rezeptors in Zellen der SSO-spezifischen Primärkultur wurde durch die vollständige Inhibition der durch ANG II hervorgerufenen transienten Erhö-hung der [Ca2+]iz in Gegenwart des auch bei Vögeln wirksamen kompetitiven Anta-gonisten [Sar1,lle8]ANG II verifiziert. Analog zu den Studien in der Primärzellkultur des SFOs konnte in zahlreichen Zellen durch Einsatz eines spezifischen Inhibitors die Konversion von vogelspezifischem ANG I zu ANG II durch ACE und folgerichtig die Generierung intrazellulärer Calciumsignale partiell bzw. vollständig inhibiert wer-den. Diese vielversprechenden Ergebnisse mögen als Ausgangbasis für weitere ver-gleichend biologische Studien dienen.
Für die Charaktierisierung Glutamat-spezifischer Rezeptorproteine wurden SFO-spezifische Primärzellkulturen für in vitro Untersuchungen herangezogen. Mit Hilfe immunzytochemischer Analysen konnten dabei die metabotropen Glutamatrezepto-ren 1 und 5 (mGluR1 und mGluR5) in SFO-spezifischen Neuronen und Astrozyten nachgewiesen werden. Außerdem wurde die Expression der mRNA für mGluR1 und mGluR5 in Zellen der SFO-spezifischen Primärzellkultur mittels PCR Untersuchun-gen gezeigt.
In zahlreichen Calcium-Imaging Studien in der SFO-spezifischen Primärkultur konnte die funktionale Expression beider Rezeptorproteine unter Einsatz subtypspe-zifischer Antagonisten für mGluR1 und mGluR5 in Neuronen und Astrozyten nach-gewiesen werden. Es wurde eruiert, dass etwa ein Drittel der SFO-spezifischen Neu-rone metabotrope Glutamatrezeptoren exprimierten, wohingegen etwa drei Viertel der Astrozyten diese Rezeptoren exprimierten. Durch den Einsatz eines Agonisten für mGluR1 und mGluR5 konnten diese Ergebnisse zusätzlich untermauert werden. Mit Hilfe spezifischer Antagonisten für NMDA- und AMPA- bzw. Kainatrezeptoren in Calcium-Imaging Versuchen wurde außerdem die funktionale Expression ionotroper
Glutamatrezeptoren in SFO-spezifischen Neuronen und Astrozyten nachgewiesen. Glutamat induzierte Calciumsignale in Neuronen wurden dementsprechend vor-nehmlich durch ionotrope, in Astrozyten hingegen durch metabotrope Glutamatre-zeptoren ausgelöst. Weiterhin wurden Glutamat induzierte Calciumsignale bei Ko-applikation mit dem 2013 entdeckten Neuropeptid Phoenixin in etwa einem Viertel der SFO-spezifischen Neurone und Astrozyten abgeschwächt.
Zur Charakterisierung eines SFO-intrinsischen RAS wurde eine neuro-gliale Primär-zellkultur dieses sensorischen CVOs aus dem Gehirn neonataler Ratten etabliert und nach vier- bis fünftägiger Kultivierung, welche der Differenzierung der Zellen diente, für in vitro Studien herangezogen. Mittels immunzytochemischer Untersuchungen unter Einsatz spezifischer Antikörper / -seren gegen einzelne Komponenten des RAS wurde die Expression des Präkursorproteins Angiotensinogen (Aogen) aus-schließlich in Vimentin-immunopositiven Zellen nachgewiesen, bei denen es sich vermutlich um Tanyzyten und / oder Astrozytenvorläuferzellen handelte. Das erst 2006 entdeckte Präkursorpeptid Angiotensin (1-12) (ANG (1-12)) wurde in SFO-intrinsischen Neuronen, und ANG II als aktive Komponente des SFO-intrinsischen RAS in perinukleären Vesikeln differenzierter Astrozyten detektiert. Des Weiteren konnte die Expression des angiotensin-converting enzyme (ACE), welches das Prä-kursorpeptid Angiotensin I (ANG I) zu ANG II konvertiert, in Neuronen, Astrozyten-vorläuferzellen und differenzierten Astrozyten verifiziert werden. Die quantitative Er-fassung der mRNA Expression für rattenspezifische(s) Aogen, Renin, ACE, Cathep-sin D und Chymasen in der SFO-spezifischen Zellkultur mittels real-time PCR ergab hohe Expressionsraten für Aogen, ACE und Cathepsin D, wohingegen Renin und Chymasen niedrige Expressionsraten zeigten. Dies stellt eine Bestätigung der im-munzytochemischen Analysen zum Nachweis der SFO-intrinsischen Biosynthese einzelner Komponenten des RAS dar.
Zahlreiche Calcium-Imaging Experimente in der SFO-spezifischen neuro-glialen Pri-märzellkultur dienten der funktionalen Expressionsanalyse wichtiger Schlüsselen-zyme (Renin, ACE, Cathepsine, Chymasen) für die SFO-intrinsische Generierung des bioaktiven Neuropeptids ANG II. So induzierte die Superfusionsstimulation der SFO-spezifischen Primärzellkultur mit Aogen, ANG (1-12) bzw. ANG I im Rahmen der Signaltransduktion – hinsichtlich ihrer Amplitude quantifizierbare – transiente in-trazelluläre Calciumsignale der Fura-2 beladenen Neurone und Astrozyten. Der Ein-satz spezifischer Inhibitoren für Renin [Aogen ANG I], ACE [ANG (1-12) bzw. ANG I ANG II] sowie Cathepsine und Chymasen [Aogen bzw. ANG (1-12) ANG II] bewirkte eine partielle bis vollständige Inhibition der durch Superfusion der Primär-kulturen mit Aogen, ANG (1-12) oder ANG I induzierten Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration ([Ca2+]iz) in quantitativ erfassten und statistisch analysierten Zellpopulationen. Dementsprechend konnte mittels Calcium-Imaging Methodik die funktionale Expression von Renin, ACE sowie Cathepsin D bzw. Chymasen in der SFO-spezifischen Primärkultur demonstriert werden.
Die mittels Immunzytochemie (ACE) und real-time PCR (Renin, ACE, Cathepsin D, Chymasen) nachgewiesene Expression enzymatischer RAS-Komponenten konnte durch die funktioalen Analysen in der Primärzellkultur bestätigt werden. Für die partielle, experimentelle Charakterisierung des vogelspezifischen SSO-intrin-sischen RAS erfolgte zunächst die de novo Etablierung einer neuro-glialen Primär-zellkultur dieses sensorischen CVOs aus dem Gehirn von Eintaggsküken, basierend auf der Optimierung der Präparationstechnik. Nach vier- bis fünftägiger Kultivierung konnten Neurone, Astrozyten und Mikrogliazellen durch den immunzytochemischen Nachweis zelltypspezifischer Markerproteine identifiziert und quantitativ erfasst wer-den. In ersten Calcium-Imaging Experimenten an Fura-2 beladenen Neuronen und Astrozyten wurde erfolgreich eine Dosis-Wirkungs-Beziehung für die durch ANG II induzierten intrazellulären Calciumsignale erstellt. Die offensichtliche Existenz eines ANG II spezifischen Rezeptors in Zellen der SSO-spezifischen Primärkultur wurde durch die vollständige Inhibition der durch ANG II hervorgerufenen transienten Erhö-hung der [Ca2+]iz in Gegenwart des auch bei Vögeln wirksamen kompetitiven Anta-gonisten [Sar1,lle8]ANG II verifiziert. Analog zu den Studien in der Primärzellkultur des SFOs konnte in zahlreichen Zellen durch Einsatz eines spezifischen Inhibitors die Konversion von vogelspezifischem ANG I zu ANG II durch ACE und folgerichtig die Generierung intrazellulärer Calciumsignale partiell bzw. vollständig inhibiert wer-den. Diese vielversprechenden Ergebnisse mögen als Ausgangbasis für weitere ver-gleichend biologische Studien dienen.
Für die Charaktierisierung Glutamat-spezifischer Rezeptorproteine wurden SFO-spezifische Primärzellkulturen für in vitro Untersuchungen herangezogen. Mit Hilfe immunzytochemischer Analysen konnten dabei die metabotropen Glutamatrezepto-ren 1 und 5 (mGluR1 und mGluR5) in SFO-spezifischen Neuronen und Astrozyten nachgewiesen werden. Außerdem wurde die Expression der mRNA für mGluR1 und mGluR5 in Zellen der SFO-spezifischen Primärzellkultur mittels PCR Untersuchun-gen gezeigt.
In zahlreichen Calcium-Imaging Studien in der SFO-spezifischen Primärkultur konnte die funktionale Expression beider Rezeptorproteine unter Einsatz subtypspe-zifischer Antagonisten für mGluR1 und mGluR5 in Neuronen und Astrozyten nach-gewiesen werden. Es wurde eruiert, dass etwa ein Drittel der SFO-spezifischen Neu-rone metabotrope Glutamatrezeptoren exprimierten, wohingegen etwa drei Viertel der Astrozyten diese Rezeptoren exprimierten. Durch den Einsatz eines Agonisten für mGluR1 und mGluR5 konnten diese Ergebnisse zusätzlich untermauert werden. Mit Hilfe spezifischer Antagonisten für NMDA- und AMPA- bzw. Kainatrezeptoren in Calcium-Imaging Versuchen wurde außerdem die funktionale Expression ionotroper
Glutamatrezeptoren in SFO-spezifischen Neuronen und Astrozyten nachgewiesen. Glutamat induzierte Calciumsignale in Neuronen wurden dementsprechend vor-nehmlich durch ionotrope, in Astrozyten hingegen durch metabotrope Glutamatre-zeptoren ausgelöst. Weiterhin wurden Glutamat induzierte Calciumsignale bei Ko-applikation mit dem 2013 entdeckten Neuropeptid Phoenixin in etwa einem Viertel der SFO-spezifischen Neurone und Astrozyten abgeschwächt.
| Erscheinungsdatum | 03.08.2019 |
|---|---|
| Reihe/Serie | Edition Scientifique |
| Sprache | deutsch |
| Maße | 146 x 210 mm |
| Gewicht | 412 g |
| Themenwelt | Veterinärmedizin |
| Schlagworte | Doktorarbeit • Uni • Wissenschaft |
| ISBN-10 | 3-8359-6804-1 / 3835968041 |
| ISBN-13 | 978-3-8359-6804-2 / 9783835968042 |
| Zustand | Neuware |
| Informationen gemäß Produktsicherheitsverordnung (GPSR) | |
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