The Role of Heat Shock Protein 90 (HSP90) in the Transformation of Theileria annulata- infected Cells and the Parasite Stage Differentiation
Seiten
2015
|
1. Aufl.
Mensch & Buch (Verlag)
978-3-86387-632-6 (ISBN)
Mensch & Buch (Verlag)
978-3-86387-632-6 (ISBN)
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Theileria annulata is an obligate intracellular parasite that causes great health problems in cattle and domestic buffalo in tropical and subtropical areas. The parasite is transmitted transstadially by several species of Hyalomma ticks.
T. annulata has a unique ability to transform and to induce a permanent proliferation of bovine leukocytes in a similar manner as tumor cells do. Among others, this transformation results in clonal expansion and metastasis of the infected cells in various organs of the affected animal. The mechanism (s) underlying the transformation process is still not entirely clear.
However, in the last years, it has been found that a number of genes are involved in the regulation of cell proliferation and / or apoptosis such as NF-κB, PI-3k/Akt and Heat shock proteins (HSPs). Moreover, HSP90 has been shown to be involved in the host cell proliferation/apoptosis as well as in stage differentiation of parasites.
Accordingly, this work was designed:
i) To investigate the functional role of HSP90 in the maintenance of the cell viability and proliferation
ii) To analyse the differential expression profile of HSP90 in T. annulata Ankara 288-infected cells under stress conditions
iii) To investigate the role of HSP90 during the developmental stages of the parasite.
In a number of studies, geldanamycin (GA) was used to inhibit the HSP90 function in cell proliferation and survival. In the present work, I also used this drug to dissect a possible impact of the HSP90 on the host-parasite interaction in Theileria-transformed bovine cells.
As a first step, the effect of HSP90 inhibition by GA on the cell viability was examined at 37°C by Trypan blue test. The percentages of dead cells were determined and was less than 20% in the cells incubated with GA (0.5 μM or 1μM) for 1 day, while this percentage increased up to 66% after 2 days. The treatment with GA ≥ 5μM showed more than 60% of dead cells after 1 day and increased up to 100% after 2 days. The flow cytometric assays for apoptosis was carried out on one hand, to verify the previous result and on the other hand, to investigate the effect of GA (0.001μM-0.5μM) at 37°C and 41°C. The analysis revealed that GA induced significant apoptosis in T. annulata Ankara 288- infected cells in a dose- and time- dependent manner. The effect of GA depended also on the incubation temperature, where low concentrations of GA could significantly induce apoptosis at 41°C.
These findings were confirmed by the immunofluorescence staining of host cell p53 as a great accumulation of p53 was observed in the host cell nucleus after treatment with GA.
The cell proliferation analysis by flow cytometry showed a significant reduction in the cell proliferation after treatment with GA ≥ 0. 05 μM for 3 days, while after 6 days incubation at 37°C only GA ≥ 0.25 μM has a similar effect.
The effect of HSP90 inhibition on the parasite differentiation in T. annulata Ankara 288- infected cells was evaluated by using two different methods. The first method was immunofluorescence staining using specific antibodies against TamS1 and TamR1, which can detect those cells in which schizonts differentiate to merozoites. The qRT-PCR was applied as another method to evaluate the expression level of TamR1 gene during the parasite differentiation. Both methods revealed that the number of the cells undergoing merogony increased in T. annulata Ankara 288-infected cells after GA treatment regardless of the incubation temperature.
The regulation of bovine HSP90 genes (BHSP90-alpha and BHSP90-beta) and T. annulata HSP90 genes (TaHSP90-Chr1 and TaHSP90-Chr4) in T. annulata Ankara 288-infected cells was evaluated by qRT-PCR. The qRT-PCR analysis showed that the mRNA expression levels of BHSP90-alpha and BHSP90-beta were significantly up-regulated after treatment with GA in a dose- and time dependent manner. In agreement with a previous result, the expression levels of TaHSP90-Chr1 mRNA and TaHSP90-Chr4 mRNA were slightly up-regulated after GA treatment at 37°C. An interesting finding was the significant decrease in the expression level of TaHSM90-Chr1 and TaHSP90-Chr4 in the cells incubated with GA at 41°C. This variance raised an important requirement for tools to distinguish between T. annulata HSP90 and bovine HSP90.
As mentioned above, reference sequences of two isoforms of T. annulata HSP90 were found and named TaHSP90-Chr1 and TaHSP90-Chr4. Characterization of TaHSP90-Chr1 and TaHSP90-Chr4 gene and its protein forms was carried out using molecular biological methods and bioinformatic analysis. Phylogenetic tree analysis indicated that TaHSP90-Chr1 and TaHSP90-Chr4 are more closely related to HSP90 from Theileria species and B .bovis than to HSP90 from human or bovine. Both TaHSP90-Chr1 and TaHSP90-Chr4 showed most of the characteristics reported for HSP90 e.g. the presence of ATP sequence, the presence of the functional HSP domain and the existence of a signal sequence located in the N-terminal sequence of the TaHSP90-Chr1 and TaHSP90-Chr4.
Antigenic peptides were deduced from the sequence of TaHSP90-Chr1 and TaHSP90-Chr4 using the predication server Predicting Antigenic Peptides (http://imed.med.ucm.es /Tools/antigenic.pl). The selected peptide was synthesized and used to immunize two rabbits. However, the anti- T. annulata HSP90 antiserum failed to recognize T. annulata HSP90 (native protein).
Regarding bovine HSP90, immunoblotting staining carried out using anti-human HSP 90α/β (HSP 90α/β (F-8): sc-13119, Santa Cruz) showed the ability of anti-human HSP 90α/β to detect bovine HSP90 in the cell lysates. Moreover, the immunofluorescence staining of T.annulata Ankara 288-infected cells showed the specificity of this antibody.
Novobiocin was used as an alternative method to distinguish between the role of bovine HSP90 and T. annulata HSP90. Although, novobiocin was utilized as a specific inhibitor of bovine HSP90, the novobiocin treatment resulted in death of the parasites also. Whether this was a direct effect on the parasite or rather on the host cell is not clear.
Nevertheless, the results of this study showed that the inactivation of HSP90 in T. annulata Ankara 288-infected cells leads to cell cycle arrest, apoptosis and differentiation of the schizonts to merozoites. - Die Rolle des Hitze-Schock-Proteins 90 (HSP90) in der Transformation von T. annulata-infizierten Zellen und der Differenzierung von Parasiten-Stadien -
Theileria annulata gehört zu den lymphoproliferativen Theilerien des Rindes. Der Parasit wird duch Hyalomma-Zecken transstadial übertragen und verursacht bei Tieren die Tropische Theileriose in subtropischen und tropischen Regionen.
Eine wichtige Eigenschaft dieser Erkrankung ist die unkontrollierte Proliferation/ Transformation der befallenen Leukozyten infizierter Wirte, die einige Eigenschaften der Tumorzellen erlangen, wie z. B. „Clonal Expansion“ und „Metastasis“ der infizierten Zellen in verschiedenen Organen des betroffen Wirtes. Die der Transformation der Wirtszellen zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind noch weitgehend ungeklärt.
In den letzten Jahren wurden einige Wirts- und Parasitenmoleküle identifiziert, die möglicherweise an der Wirtszellproliferation bzw. -apoptose beteiligt sind, wie zB. NFkB und P53. Es wird zunehmend auf die Rolle der Hitzeschockproteine (HSP) bei der Regulation der Zellapoptose hingewiesen. Darüber hinaus wird über die Bedeutung von HSP90 bei der Differenzierung bestimmter Parasitenstadien berichtet.
Die Hauptziele der vorliegenden Doktorarbeit waren:
i) Die Rolle von HSP90 bei der Aufrechterhaltung der Vitalität und Proliferation T. annulata-infizierter Zellen zu untersuchen,
ii) das Expressionsprofil von HSP90 unter Stressbedingungen in T. annulata-infizierten Zellen zu analysieren und
iii) die Bedeutung von HSP90 bei der Differenzierung der Schizonten zu Merozoiten zu klären.
In eine Reihe von Untersuchungen wurde Geldanamycin (GA) benutzt, um die Funktion von HSP90 zu inhibieren und dessen Einfluss auf Proliferation und Vitalität der Zellen zu untersuchen. In der vorliegenden Arbeit wurde GA auch verwendet, um einen möglichen Einfluss von HSP90 auf die Wirt-Parasiten-Interaktion in Theileria-transformierten bovinen Zellen zu untersuchen.
Zu nächst wurden die parasitenhaltigen Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von Geldanamycin (GA) behandelt und anschließend für unterschiedliche Zeiten bei 37°C inkubiert. Der Effekt wurde mit dem Trypan-Blau-Test untersucht.
Bei einer GA Konzentration von 0.5 μM und 1μM und einer Inkubationszeit von einem Tag bei 37°C, lag der prozentuale Anteil toter Zellen bei weniger als 20%. Diese Zahl stieg jedoch breits nach zwei Tagen auf 66%. Mehr als 60% der für einen Tag mit ≥ 5μM GA behandelten Zellen waren tot. Bei einer Verlängerung der Inkubationszeit auf 2 Tage waren alle Zellen abgestorben.
Zur Klärung der Frage, ob die Apoptose ursächlich für den Tot der Zellen verantwortlich ist, wurde eine Durchfluss-Zytometrie zur Erfassung apoptotischer Zellen durchgeführt. Darüber hinaus wurde das gleiche Verfahren zur Untersuchung des Effektes von geringeren Konzentrationen von GA (0.001 μM-0.5 μM) bei 37°C und 41°C eingesetzt. Die Analyse der erzielten Ergebnisse zeigte, dass GA die Apoptose in T. annulata Ankara288-infizierten Zellen in Abhängigkeit von Dosis und Inkubationszeit signifikant induzieren kann. Der Effekt von GA hing dabei auch von der Inkubationstemperatur ab, wobei auch niedrige Konzentrationen von GA bei 41°C eine Apoptose signifikant induzieren konnten.
Diese Ergebnisse wurden durch eine Immunofluoreszenz-Färbung des Wirtszellproteins p53 bestätigt. Hierbei wurde eine hohe Akkumulation von p53 im Wirtszellkern nach der Behandlung mit GA nachgewiesen.
Die Analyse der Zellproliferation mit Hilfe der Durchfluss-Zytometrie zeigte eine signifikante Reduzierung der Zellproliferation nach der Behandlung mit GA ≥ 0.05μM für 3 Tage. Ein ähnlicher Effekt wurde mit einer Inkubationszeit von 6 Tagen und einer Konzentration von GA ≥ 0.25μM erzielt.
Der Effekt von HSP90 auf die Differenzierung der Parasitenstadien wurde mit Hilfe zweier Methoden untersucht. So wurde zum einen eine Immunofluoreszenz-Färbung mit den spezifischen Merozoiten-Markern TamS1 und TamR1 durchgeführt. Zum anderen wurde eine qRT-PCR zur Bestimmung der Höhe der Genexpression von TamR1 durchgeführt. Beide Methoden zeigten, dass die Anzahl der Zellen in Merogonie nach der Behandlung mit GA steigt, unabhängig von der Inkubationstemperatur.
Die Regulation des bovinen HSP90-Gens (BHSP90-alpha und BHSP90-beta) sowie des T. annulata HSP90-Gens (TaHSP90-Chr1 und TaHSP90-Chr4) wurde mit Hilfe einer qRT-PCR evaluiert. Beide Isoformen des bovinen Gens zeigten eine signifikante Hochregulation nach der Behandlung mit GA in einer konzentrations- und inkubationszeitabhängigen Weise.
Die Expression der TaHSP90-Chr1 mRNA und TaHSP90-Chr4 mRNA war auch von der Inkubationstemperatur abhängig. Während die Expression der mRNA beider Parasiten-HSP90-Isoformen nach der Behandlung der Zellen mit GA bei 37°C leicht, jedoch nicht signifikant hochreguliert war, nahm die Expression der mRNA dieser Gene bei 41°C signifikant ab. Dieses überraschende Ergebnis kann möglicherweise mit der Freisetzung der Parasiten aus den Wirtszellen während der Differerenzierung der Schizonten zu Merozoiten assoziiert sein.
Die Charakterisierung der TaHSP90-Chr1 und TaHSP90-Chr4 Gen- und Proteinformen wurde mittels molekularer Methoden sowie mit Hilfe bioinformatischer Analysen durchgeführt. Eine Analyse der Phylogenie deutete darauf hin, dass beide Isoformen mit dem HSP90 von Theileria annulata und Babesia ovis näher verwandt sind als mit dem humanen bzw. dem bovinen HSP90. Beide hier untersuchten Isoformen zeigten die Eigenschaften von HSP90, wie z. B. die Anwesenheit einer ATP-Sequenz, die Anwesenheit einer funktionalen HSP-Domäne sowie die Existenz einer Signal-Sequenz in der N-terminalen Sequenz.
Antigene Peptide wurden mit Hilfe der Internetseite „Predicting Antigenic Peptides“ (http://imed.med.ucm.es /Tools/antigenic.pl) aus der Sequenz von TaHSP90-Chr1 und TaHSP90-Chr4 abgeleitet. Die selektierten Peptide wurden synthetisiert und genutzt, um zwei Kaninchen zu immunisieren. Leider erkannte das anti-T. annulata HSP90-Antiserum das native HSP90 Protein nicht.
In Bezug auf das bovine HSP90 wurde eine Immunoblot-Färbung unter Verwendung des anti-humanen HSP90α/β (HSP 90α/β (F-8): sc-13119, Santa Cruz) durchgeführt. Hier wurde gezeigt, dass ein Antiserum gegen das humane HSP 90α/β das bovine HSP90 im Zelllysat detektieren kann. Darüber hinaus wurde die Spezifität dieses Antikörpers nachgewiesen.
Als alternative Methode für die Unterscheidung zwischen dem Einfluss des bovinen und des T-annulata HSP90 wurde Novobiocin herangezogen. Obwohl Novobiocin als spezifischer Inhibitor des bovinen HSP90 eingesetzt wird, zeigte sich nach der Behandlung mit Novobiocin jedoch, dass auch die Parasiten starben. Ob Novobiocin jedoch einen direkten Einfluss auf den Parasiten hat, oder dieser Effekt mit dem Tod der Wirtszellen zusammenhängt, ist jedoch unklar.
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Doktorarbeit, dass die Inaktivierung der Funktion von HSP90 durch Geldanamycin zu Zellzyklusarrest, Apoptose und möglicherweise zur Differenzierung der Schizonten zu Merozoiten in T. annulata Ankara 288-infizierten Wirtszellen führt.
T. annulata has a unique ability to transform and to induce a permanent proliferation of bovine leukocytes in a similar manner as tumor cells do. Among others, this transformation results in clonal expansion and metastasis of the infected cells in various organs of the affected animal. The mechanism (s) underlying the transformation process is still not entirely clear.
However, in the last years, it has been found that a number of genes are involved in the regulation of cell proliferation and / or apoptosis such as NF-κB, PI-3k/Akt and Heat shock proteins (HSPs). Moreover, HSP90 has been shown to be involved in the host cell proliferation/apoptosis as well as in stage differentiation of parasites.
Accordingly, this work was designed:
i) To investigate the functional role of HSP90 in the maintenance of the cell viability and proliferation
ii) To analyse the differential expression profile of HSP90 in T. annulata Ankara 288-infected cells under stress conditions
iii) To investigate the role of HSP90 during the developmental stages of the parasite.
In a number of studies, geldanamycin (GA) was used to inhibit the HSP90 function in cell proliferation and survival. In the present work, I also used this drug to dissect a possible impact of the HSP90 on the host-parasite interaction in Theileria-transformed bovine cells.
As a first step, the effect of HSP90 inhibition by GA on the cell viability was examined at 37°C by Trypan blue test. The percentages of dead cells were determined and was less than 20% in the cells incubated with GA (0.5 μM or 1μM) for 1 day, while this percentage increased up to 66% after 2 days. The treatment with GA ≥ 5μM showed more than 60% of dead cells after 1 day and increased up to 100% after 2 days. The flow cytometric assays for apoptosis was carried out on one hand, to verify the previous result and on the other hand, to investigate the effect of GA (0.001μM-0.5μM) at 37°C and 41°C. The analysis revealed that GA induced significant apoptosis in T. annulata Ankara 288- infected cells in a dose- and time- dependent manner. The effect of GA depended also on the incubation temperature, where low concentrations of GA could significantly induce apoptosis at 41°C.
These findings were confirmed by the immunofluorescence staining of host cell p53 as a great accumulation of p53 was observed in the host cell nucleus after treatment with GA.
The cell proliferation analysis by flow cytometry showed a significant reduction in the cell proliferation after treatment with GA ≥ 0. 05 μM for 3 days, while after 6 days incubation at 37°C only GA ≥ 0.25 μM has a similar effect.
The effect of HSP90 inhibition on the parasite differentiation in T. annulata Ankara 288- infected cells was evaluated by using two different methods. The first method was immunofluorescence staining using specific antibodies against TamS1 and TamR1, which can detect those cells in which schizonts differentiate to merozoites. The qRT-PCR was applied as another method to evaluate the expression level of TamR1 gene during the parasite differentiation. Both methods revealed that the number of the cells undergoing merogony increased in T. annulata Ankara 288-infected cells after GA treatment regardless of the incubation temperature.
The regulation of bovine HSP90 genes (BHSP90-alpha and BHSP90-beta) and T. annulata HSP90 genes (TaHSP90-Chr1 and TaHSP90-Chr4) in T. annulata Ankara 288-infected cells was evaluated by qRT-PCR. The qRT-PCR analysis showed that the mRNA expression levels of BHSP90-alpha and BHSP90-beta were significantly up-regulated after treatment with GA in a dose- and time dependent manner. In agreement with a previous result, the expression levels of TaHSP90-Chr1 mRNA and TaHSP90-Chr4 mRNA were slightly up-regulated after GA treatment at 37°C. An interesting finding was the significant decrease in the expression level of TaHSM90-Chr1 and TaHSP90-Chr4 in the cells incubated with GA at 41°C. This variance raised an important requirement for tools to distinguish between T. annulata HSP90 and bovine HSP90.
As mentioned above, reference sequences of two isoforms of T. annulata HSP90 were found and named TaHSP90-Chr1 and TaHSP90-Chr4. Characterization of TaHSP90-Chr1 and TaHSP90-Chr4 gene and its protein forms was carried out using molecular biological methods and bioinformatic analysis. Phylogenetic tree analysis indicated that TaHSP90-Chr1 and TaHSP90-Chr4 are more closely related to HSP90 from Theileria species and B .bovis than to HSP90 from human or bovine. Both TaHSP90-Chr1 and TaHSP90-Chr4 showed most of the characteristics reported for HSP90 e.g. the presence of ATP sequence, the presence of the functional HSP domain and the existence of a signal sequence located in the N-terminal sequence of the TaHSP90-Chr1 and TaHSP90-Chr4.
Antigenic peptides were deduced from the sequence of TaHSP90-Chr1 and TaHSP90-Chr4 using the predication server Predicting Antigenic Peptides (http://imed.med.ucm.es /Tools/antigenic.pl). The selected peptide was synthesized and used to immunize two rabbits. However, the anti- T. annulata HSP90 antiserum failed to recognize T. annulata HSP90 (native protein).
Regarding bovine HSP90, immunoblotting staining carried out using anti-human HSP 90α/β (HSP 90α/β (F-8): sc-13119, Santa Cruz) showed the ability of anti-human HSP 90α/β to detect bovine HSP90 in the cell lysates. Moreover, the immunofluorescence staining of T.annulata Ankara 288-infected cells showed the specificity of this antibody.
Novobiocin was used as an alternative method to distinguish between the role of bovine HSP90 and T. annulata HSP90. Although, novobiocin was utilized as a specific inhibitor of bovine HSP90, the novobiocin treatment resulted in death of the parasites also. Whether this was a direct effect on the parasite or rather on the host cell is not clear.
Nevertheless, the results of this study showed that the inactivation of HSP90 in T. annulata Ankara 288-infected cells leads to cell cycle arrest, apoptosis and differentiation of the schizonts to merozoites. - Die Rolle des Hitze-Schock-Proteins 90 (HSP90) in der Transformation von T. annulata-infizierten Zellen und der Differenzierung von Parasiten-Stadien -
Theileria annulata gehört zu den lymphoproliferativen Theilerien des Rindes. Der Parasit wird duch Hyalomma-Zecken transstadial übertragen und verursacht bei Tieren die Tropische Theileriose in subtropischen und tropischen Regionen.
Eine wichtige Eigenschaft dieser Erkrankung ist die unkontrollierte Proliferation/ Transformation der befallenen Leukozyten infizierter Wirte, die einige Eigenschaften der Tumorzellen erlangen, wie z. B. „Clonal Expansion“ und „Metastasis“ der infizierten Zellen in verschiedenen Organen des betroffen Wirtes. Die der Transformation der Wirtszellen zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind noch weitgehend ungeklärt.
In den letzten Jahren wurden einige Wirts- und Parasitenmoleküle identifiziert, die möglicherweise an der Wirtszellproliferation bzw. -apoptose beteiligt sind, wie zB. NFkB und P53. Es wird zunehmend auf die Rolle der Hitzeschockproteine (HSP) bei der Regulation der Zellapoptose hingewiesen. Darüber hinaus wird über die Bedeutung von HSP90 bei der Differenzierung bestimmter Parasitenstadien berichtet.
Die Hauptziele der vorliegenden Doktorarbeit waren:
i) Die Rolle von HSP90 bei der Aufrechterhaltung der Vitalität und Proliferation T. annulata-infizierter Zellen zu untersuchen,
ii) das Expressionsprofil von HSP90 unter Stressbedingungen in T. annulata-infizierten Zellen zu analysieren und
iii) die Bedeutung von HSP90 bei der Differenzierung der Schizonten zu Merozoiten zu klären.
In eine Reihe von Untersuchungen wurde Geldanamycin (GA) benutzt, um die Funktion von HSP90 zu inhibieren und dessen Einfluss auf Proliferation und Vitalität der Zellen zu untersuchen. In der vorliegenden Arbeit wurde GA auch verwendet, um einen möglichen Einfluss von HSP90 auf die Wirt-Parasiten-Interaktion in Theileria-transformierten bovinen Zellen zu untersuchen.
Zu nächst wurden die parasitenhaltigen Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von Geldanamycin (GA) behandelt und anschließend für unterschiedliche Zeiten bei 37°C inkubiert. Der Effekt wurde mit dem Trypan-Blau-Test untersucht.
Bei einer GA Konzentration von 0.5 μM und 1μM und einer Inkubationszeit von einem Tag bei 37°C, lag der prozentuale Anteil toter Zellen bei weniger als 20%. Diese Zahl stieg jedoch breits nach zwei Tagen auf 66%. Mehr als 60% der für einen Tag mit ≥ 5μM GA behandelten Zellen waren tot. Bei einer Verlängerung der Inkubationszeit auf 2 Tage waren alle Zellen abgestorben.
Zur Klärung der Frage, ob die Apoptose ursächlich für den Tot der Zellen verantwortlich ist, wurde eine Durchfluss-Zytometrie zur Erfassung apoptotischer Zellen durchgeführt. Darüber hinaus wurde das gleiche Verfahren zur Untersuchung des Effektes von geringeren Konzentrationen von GA (0.001 μM-0.5 μM) bei 37°C und 41°C eingesetzt. Die Analyse der erzielten Ergebnisse zeigte, dass GA die Apoptose in T. annulata Ankara288-infizierten Zellen in Abhängigkeit von Dosis und Inkubationszeit signifikant induzieren kann. Der Effekt von GA hing dabei auch von der Inkubationstemperatur ab, wobei auch niedrige Konzentrationen von GA bei 41°C eine Apoptose signifikant induzieren konnten.
Diese Ergebnisse wurden durch eine Immunofluoreszenz-Färbung des Wirtszellproteins p53 bestätigt. Hierbei wurde eine hohe Akkumulation von p53 im Wirtszellkern nach der Behandlung mit GA nachgewiesen.
Die Analyse der Zellproliferation mit Hilfe der Durchfluss-Zytometrie zeigte eine signifikante Reduzierung der Zellproliferation nach der Behandlung mit GA ≥ 0.05μM für 3 Tage. Ein ähnlicher Effekt wurde mit einer Inkubationszeit von 6 Tagen und einer Konzentration von GA ≥ 0.25μM erzielt.
Der Effekt von HSP90 auf die Differenzierung der Parasitenstadien wurde mit Hilfe zweier Methoden untersucht. So wurde zum einen eine Immunofluoreszenz-Färbung mit den spezifischen Merozoiten-Markern TamS1 und TamR1 durchgeführt. Zum anderen wurde eine qRT-PCR zur Bestimmung der Höhe der Genexpression von TamR1 durchgeführt. Beide Methoden zeigten, dass die Anzahl der Zellen in Merogonie nach der Behandlung mit GA steigt, unabhängig von der Inkubationstemperatur.
Die Regulation des bovinen HSP90-Gens (BHSP90-alpha und BHSP90-beta) sowie des T. annulata HSP90-Gens (TaHSP90-Chr1 und TaHSP90-Chr4) wurde mit Hilfe einer qRT-PCR evaluiert. Beide Isoformen des bovinen Gens zeigten eine signifikante Hochregulation nach der Behandlung mit GA in einer konzentrations- und inkubationszeitabhängigen Weise.
Die Expression der TaHSP90-Chr1 mRNA und TaHSP90-Chr4 mRNA war auch von der Inkubationstemperatur abhängig. Während die Expression der mRNA beider Parasiten-HSP90-Isoformen nach der Behandlung der Zellen mit GA bei 37°C leicht, jedoch nicht signifikant hochreguliert war, nahm die Expression der mRNA dieser Gene bei 41°C signifikant ab. Dieses überraschende Ergebnis kann möglicherweise mit der Freisetzung der Parasiten aus den Wirtszellen während der Differerenzierung der Schizonten zu Merozoiten assoziiert sein.
Die Charakterisierung der TaHSP90-Chr1 und TaHSP90-Chr4 Gen- und Proteinformen wurde mittels molekularer Methoden sowie mit Hilfe bioinformatischer Analysen durchgeführt. Eine Analyse der Phylogenie deutete darauf hin, dass beide Isoformen mit dem HSP90 von Theileria annulata und Babesia ovis näher verwandt sind als mit dem humanen bzw. dem bovinen HSP90. Beide hier untersuchten Isoformen zeigten die Eigenschaften von HSP90, wie z. B. die Anwesenheit einer ATP-Sequenz, die Anwesenheit einer funktionalen HSP-Domäne sowie die Existenz einer Signal-Sequenz in der N-terminalen Sequenz.
Antigene Peptide wurden mit Hilfe der Internetseite „Predicting Antigenic Peptides“ (http://imed.med.ucm.es /Tools/antigenic.pl) aus der Sequenz von TaHSP90-Chr1 und TaHSP90-Chr4 abgeleitet. Die selektierten Peptide wurden synthetisiert und genutzt, um zwei Kaninchen zu immunisieren. Leider erkannte das anti-T. annulata HSP90-Antiserum das native HSP90 Protein nicht.
In Bezug auf das bovine HSP90 wurde eine Immunoblot-Färbung unter Verwendung des anti-humanen HSP90α/β (HSP 90α/β (F-8): sc-13119, Santa Cruz) durchgeführt. Hier wurde gezeigt, dass ein Antiserum gegen das humane HSP 90α/β das bovine HSP90 im Zelllysat detektieren kann. Darüber hinaus wurde die Spezifität dieses Antikörpers nachgewiesen.
Als alternative Methode für die Unterscheidung zwischen dem Einfluss des bovinen und des T-annulata HSP90 wurde Novobiocin herangezogen. Obwohl Novobiocin als spezifischer Inhibitor des bovinen HSP90 eingesetzt wird, zeigte sich nach der Behandlung mit Novobiocin jedoch, dass auch die Parasiten starben. Ob Novobiocin jedoch einen direkten Einfluss auf den Parasiten hat, oder dieser Effekt mit dem Tod der Wirtszellen zusammenhängt, ist jedoch unklar.
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Doktorarbeit, dass die Inaktivierung der Funktion von HSP90 durch Geldanamycin zu Zellzyklusarrest, Apoptose und möglicherweise zur Differenzierung der Schizonten zu Merozoiten in T. annulata Ankara 288-infizierten Wirtszellen führt.
| Erscheinungsdatum | 11.01.2018 |
|---|---|
| Verlagsort | Berlin |
| Sprache | englisch |
| Themenwelt | Veterinärmedizin ► Klinische Fächer ► Parasitologie |
| Schlagworte | Apoptosis • buffaloes • cattle • cell proliferation (MeSH) • chain reaction • Differentiation • Heat shock proteins • Theileria annulata • Transformation |
| ISBN-10 | 3-86387-632-6 / 3863876326 |
| ISBN-13 | 978-3-86387-632-6 / 9783863876326 |
| Zustand | Neuware |
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