Untersuchungen zur Lokalisation und Funktiondes Orphan Carriers SLC10A5 in vitro und im Slc10a5-Knockout-Mausmodell
Seiten
2015
VVB Laufersweiler Verlag
978-3-8359-6375-7 (ISBN)
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SLC10A5 wurde nach seiner Entdeckung aufgrund von Sequenzhomologie in die SLC10-Familie, auch Familie der Na+-abhängigen Gallensäuretransporter genannt, eingeordnet. Er wurde als potenzieller Gallensäuretransporter angesehen, da sich zusätzlich sein Expressionsprofil, das die höchsten Werte in Leber, Niere und Magen-Darm-Trakt zeigte, mit den gut charakterisierten Gründungsmitgliedern NTCP und ASBT überschnitt, welche zusammen den enterohepatischen Kreislauf der Gallensäuren aufrechterhalten. Jedoch wurde bislang keine Transportaktivität für Gallensäuren aufgezeigt.
In der vorliegenden Arbeit wurden erstmalig die Lokalisation und Funktion des SLC10A5 näher untersucht. Das SLC10A5-Protein von Mensch, Maus und Ratte wurde in transfizierten HEK293- und HepG2-Zellen intrazellulär im Endoplasmatischen Retikulum und dem Golgi-Apparat nachgewiesen. Die Lokalisation auf subzellulärer Ebene konnte im Gewebe nicht abschließend geklärt werden, da zwei eingesetzte kommerzielle Antikörper gegen das humane SLC10A5-Protein keine spezifische Bindung aufwiesen und ein gegen den C-Terminus des SLC10A5 der Ratte generierter Antikörper in Immunhistologie- und Western-Blot-Analysen an Ratten- und Mausgewebe Mitochondrien markierte, jedoch auch mit dem Gewebe der Slc10a5-Knockoutmaus reagierte. In vitro konnte an mit humanem SLC10A5-V5-transfizierten HEK293-Zellen weder mit radioaktiv- noch mit fluoreszenzmarkierten Gallensäuren eine Transportfunktion nachgewiesen werden.
Mit der Slc10a5-Knockout-Maus (B6.129S5-Slc10a5tm1Lex) stand jedoch ein In-vivo-Modell zur Aufklärung der physiologischen SLC10A5-Funktion zur Verfügung. Unter Standardhaltungsbedingungen zeigten die homozygot-defekten Mäuse allerdings keinen auffälligen Phänotyp, sondern waren trotz geringfügig geringeren Körpergewichts gesund und fertil. Durch einwöchige Fütterung mit 0,5 % Cholsäure-haltiger Diät konnten signifikante Unterschiede zwischen den Slc10a5-Knockout-Mäusen und den C57BL/6N-Kontroll-Mäusen induziert werden. Die Gallen- und Plasmazusammensetzung wurde mittels UHPLC-MS/MS bestimmt. Unter Kontrollfütterung glichen sich Gallemenge, Gallensäure-, Phospholipid und Cholesterinkonzentrationen und ließen sich durch die Fütterung mit Cholsäure bei beiden Genotypen erhöhen. Jedoch schieden die Knockout-Mäuse bei gleicher Gesamtgallensäurekonzentration zwanzig Mal soviel unkonjugierte Gallensäuren wie die Wildtypmäuse aus, was auf eine begrenzte Fähigkeit hindeutet, Gallensäuren zu rekonjugieren. Zusätzlich verschob sich das bei Kontrollfütterung zwischen den Genotypen gleiche Verhältnis der Gallensäuren mit Taurocholat, Tauromurocholat, Tauro-7-Deoxycholat und Taurodeoxycholat als Hauptgallensäuren durch die Fütterung mit Cholsäure. Taurocholat stellte weiterhin den größten Anteil dar, aber während bei den Wildtyp-Mäusen Taurodeoxycholat circa ein Viertel der Gallensäuren ausmachte, sank der Anteil bei den Knockout-Mäusen auf unter 1 %, welche dafür zu etwa einem Viertel Cholat und einen vermehrten (Tauro-)7-oxo-Deoxycholat-Gehalt aufwiesen. Einher gingen diese Cholsäure-induzierten Veränderungen mit einer Hyperämie und Schwellung des Dünndarms bei den Knockout-Mäusen.
Bei Standardhaltung der Slc10a5-Knockout-Mäuse konnten keine Unterschiede in der Genexpression von Gallensäuretransportern oder der in Synthese und Metabolismus involvierten Enzyme in einer genomweiten Array-Analyse der Leber-RNA detektiert werden. Die Cholsäurefütterung induzierte Anpassungen der Genexpression in beiden Genotypen, jedoch nur geringe Expressionsunterschiede zwischen den Knockout- und Wildtypmäusen, welche nicht in der Lage sind, den beschriebenen Phänotyp zu erklären. Ein Einfluss des SLC10A5 auf den Prozess der Rekonjugation von Gallensäuren in der Leber ist somit wahrscheinlich, jedoch muss seine physiologische Funktion – auch in den anderen hoch-exprimierenden Geweben – weiter aufgeklärt werden.
In der vorliegenden Arbeit wurden erstmalig die Lokalisation und Funktion des SLC10A5 näher untersucht. Das SLC10A5-Protein von Mensch, Maus und Ratte wurde in transfizierten HEK293- und HepG2-Zellen intrazellulär im Endoplasmatischen Retikulum und dem Golgi-Apparat nachgewiesen. Die Lokalisation auf subzellulärer Ebene konnte im Gewebe nicht abschließend geklärt werden, da zwei eingesetzte kommerzielle Antikörper gegen das humane SLC10A5-Protein keine spezifische Bindung aufwiesen und ein gegen den C-Terminus des SLC10A5 der Ratte generierter Antikörper in Immunhistologie- und Western-Blot-Analysen an Ratten- und Mausgewebe Mitochondrien markierte, jedoch auch mit dem Gewebe der Slc10a5-Knockoutmaus reagierte. In vitro konnte an mit humanem SLC10A5-V5-transfizierten HEK293-Zellen weder mit radioaktiv- noch mit fluoreszenzmarkierten Gallensäuren eine Transportfunktion nachgewiesen werden.
Mit der Slc10a5-Knockout-Maus (B6.129S5-Slc10a5tm1Lex) stand jedoch ein In-vivo-Modell zur Aufklärung der physiologischen SLC10A5-Funktion zur Verfügung. Unter Standardhaltungsbedingungen zeigten die homozygot-defekten Mäuse allerdings keinen auffälligen Phänotyp, sondern waren trotz geringfügig geringeren Körpergewichts gesund und fertil. Durch einwöchige Fütterung mit 0,5 % Cholsäure-haltiger Diät konnten signifikante Unterschiede zwischen den Slc10a5-Knockout-Mäusen und den C57BL/6N-Kontroll-Mäusen induziert werden. Die Gallen- und Plasmazusammensetzung wurde mittels UHPLC-MS/MS bestimmt. Unter Kontrollfütterung glichen sich Gallemenge, Gallensäure-, Phospholipid und Cholesterinkonzentrationen und ließen sich durch die Fütterung mit Cholsäure bei beiden Genotypen erhöhen. Jedoch schieden die Knockout-Mäuse bei gleicher Gesamtgallensäurekonzentration zwanzig Mal soviel unkonjugierte Gallensäuren wie die Wildtypmäuse aus, was auf eine begrenzte Fähigkeit hindeutet, Gallensäuren zu rekonjugieren. Zusätzlich verschob sich das bei Kontrollfütterung zwischen den Genotypen gleiche Verhältnis der Gallensäuren mit Taurocholat, Tauromurocholat, Tauro-7-Deoxycholat und Taurodeoxycholat als Hauptgallensäuren durch die Fütterung mit Cholsäure. Taurocholat stellte weiterhin den größten Anteil dar, aber während bei den Wildtyp-Mäusen Taurodeoxycholat circa ein Viertel der Gallensäuren ausmachte, sank der Anteil bei den Knockout-Mäusen auf unter 1 %, welche dafür zu etwa einem Viertel Cholat und einen vermehrten (Tauro-)7-oxo-Deoxycholat-Gehalt aufwiesen. Einher gingen diese Cholsäure-induzierten Veränderungen mit einer Hyperämie und Schwellung des Dünndarms bei den Knockout-Mäusen.
Bei Standardhaltung der Slc10a5-Knockout-Mäuse konnten keine Unterschiede in der Genexpression von Gallensäuretransportern oder der in Synthese und Metabolismus involvierten Enzyme in einer genomweiten Array-Analyse der Leber-RNA detektiert werden. Die Cholsäurefütterung induzierte Anpassungen der Genexpression in beiden Genotypen, jedoch nur geringe Expressionsunterschiede zwischen den Knockout- und Wildtypmäusen, welche nicht in der Lage sind, den beschriebenen Phänotyp zu erklären. Ein Einfluss des SLC10A5 auf den Prozess der Rekonjugation von Gallensäuren in der Leber ist somit wahrscheinlich, jedoch muss seine physiologische Funktion – auch in den anderen hoch-exprimierenden Geweben – weiter aufgeklärt werden.
| Erscheint lt. Verlag | 6.11.2015 |
|---|---|
| Reihe/Serie | Edition Scientifique |
| Sprache | deutsch |
| Maße | 146 x 210 mm |
| Gewicht | 305 g |
| Einbandart | Paperback |
| Themenwelt | Veterinärmedizin |
| Schlagworte | Doktorarbeit • Uni • Wissenschaft |
| ISBN-10 | 3-8359-6375-9 / 3835963759 |
| ISBN-13 | 978-3-8359-6375-7 / 9783835963757 |
| Zustand | Neuware |
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