Etablierung und Evaluierung eines Capture-ELISAs zum Nachweis des Beta2-Toxins von Clostridium perfringens aus Feldisolaten

Alexa Sommer (Autor)

Buch

120 Seiten

2015
VVB Laufersweiler Verlag
978-3-8359-6356-6 (ISBN)

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Beta2-Toxingen-positive C. perfringens Typ A- und C-Stämme werden häufig bei Durchfallerkrankungen von Saugferkeln isoliert. Die Bedeutung des Beta2-Toxins in der Pathogenese ist bisher nicht eindeutig geklärt. Der Nachweis Beta2-Toxingen-positiver Stämme, die mittels PCR identifiziert werden, läßt keinerlei Aussage darüber zu, ob und wie viel Beta2-Toxin während der Vermehrung in den Kulturüberstand exprimiert wird. Es wurde daher versucht, eine quantitative Methode zu entwickeln, die eine Bestimmung des Beta2-Toxingehalts in C. perfringens-Kulturüberständen erlaubt. Zu diesem Zweck wurde in der vorliegenden Arbeit ein Fangantikörper-ELISA zum Nachweis von Beta2-Toxin aus C. perfringens-Kulturüberständen entwickelt. Der Test wurde auf seine Eignung für den quantitativen Nachweis von Beta2-Toxin in C. perfringens-Kulturüberständen, die von Isolaten aus Kotproben gesunder und durchfallerkrankter Ferkel gewonnen wurden, geprüft. Mittels pASK-IBA2 Vektor gelang die gezielte Expression eines rekombinanten Beta2-Toxins aus E. coli. Unter Verwendung des affinitätchromatographisch aufgereinigten rBeta2-Toxins konnten nach Immunisierung, Wildtyptoxin-erkennende polyklonale (pAk) und zwei monoklonale Antikörper (2-4A5 und 2-4C11) gewonnen werden. Unter Verwendung von C. perfringens-Kulturüberständen sowie Kulturüberständen weiterer grampositiver und gramnegativer Keime wurde der entwickelte Fangantikörper-ELISA auf Reproduzierbarkeit, Verdünnungsechtheit, Sensitivität und Spezifität getestet. Mittels Inter-Assay-Präzision wurde die Reproduzierbarkeit bzw. der Grad der Schwankungen des ELSIA zu unterschiedlichen Zeitpunkten bei wiederholter Testung gemessen, wobei der Variationskoeffizient <20% betrug, was einer hinreichenden Genauigkeit entspricht. Mittels Intra-Assay-Präzision wurden die Schwankungen innerhalb eines Ansatzes überprüft und die gute Reproduzierbarkeit des Systems, mit einem Variationskoeffizienten <20%, bestätigt. Die Sensitivität des Beta2-spezifischen Fangantikörper-ELISAs lag nach Untersuchungen mit 18 genotypisch Beta2-positiven C. perfringens-Feldisolaten bei 100 %. Kulturüberstände anderer Clostridienspezies sowie grampositiver und gramnegativer Keime zeigten keinerlei Kreuzreaktion mit den im Fangantikörper-ELISA verwendeten Nachweisantikörpern. Daraus ergab sich eine Diagnostik-Spezifität von 100%. 48 C. perfringens-Feldisolate, die von Kotproben gesunder und kranker Ferkel stammten, wurden mittels des Beta2-spezifischen Fangantikörper-ELISAs untersucht. Der gemessene Beta2-Toxin Gehalt in den Kulturüberständen von Isolaten aus Kotproben erkrankter Tiere, zeigte bei beiden mAk (2-4A5 und 2-4C11) fünffach höhere Werte als die bei den Isolaten gesunder Saugferkel. Im genotypischen Nachweis handelte es sich um 88 % Typ A-Stämme und 12 % Typ C-Stämme. Darüber hinaus wurde untersucht, ob bei nativem und rekombinantem Beta2-Toxin eine zytotoxische Wirkung nachgewiesen werden kann. An verschiedenen Zelllinien ließ sich sowohl für das native als auch das rekombinante Toxin eine Zytotoxität nachweisen, wobei das native Beta2-Toxin eine bis zu achtfach höhere Zytotoxizität gegenüber dem rekombinant hergestellten Beta2-Toxin aufwies. In weiteren Versuchen an Kaninchen- und Ferkelerythrozyten zur Hämolyse-Wirkung von Alphatoxin war festzustellen, dass die Alphatoxin-induzierte Hämolyse durch Zugabe von rBeta2-Toxin signifikant gesteigert werden konnte, was deutliche Hinweise auf einen Synergismus beider Toxine gibt. Dies wird bestätigt durch die Tatsache, dass sich dieser Effekt durch Zugabe des Beta2-spezifischen mAk 2-4C11 zum Präinkubationsgemisch (rBeta2 und PLC) aufheben ließ. Der hier entwickelte Fangantikörper-ELISA stellt eine geeignete Methode zum quantitativen Nachweis von Beta2-Toxin in C. perfringens-Kulturüberständen unter Routinebedingungen dar.

Erscheint lt. Verlag	30.9.2015
Reihe/Serie	Edition Scientifique
Sprache	deutsch
Einbandart	Paperback
Themenwelt	Veterinärmedizin
Schlagworte	Doktorarbeit • Uni • Wissenschaft
ISBN-10	3-8359-6356-2 / 3835963562
ISBN-13	978-3-8359-6356-6 / 9783835963566
Zustand	Neuware