CRISPR/Cas9 vermittelter Knockout von NHEJ-Signalweg-Proteinen
CRISPR/Cas9 mediated knockout of NHEJ pathway proteins
Seiten
2021
VVB Laufersweiler Verlag
978-3-8359-7008-3 (ISBN)
VVB Laufersweiler Verlag
978-3-8359-7008-3 (ISBN)
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Das therapeutische Genome Editing ist eine Methode, um krankheitsverursachende Mutationen direkt am Genom der Betroffenen zu therapieren. Sie findet Anwendung u.a. in der Ophthalmologie zur Erforschung und Erarbeitung von Therapiestrategien für erbliche Netzhauterkrankungen. Das Prinzip des Genome Editing beruht auf der Verwendung von Designer-Endonukleasen, wobei das derzeit bedeutendste Werkzeug das CRISPR/Cas9-System darstellt. Dieses ermöglicht zielgenau Doppelstrangbrüche im Genom zu erzeugen, welche im Anschluss durch zelleigene Reparaturmechanismen, wie das NHEJ, MMEJ und HDR, verschlossen werden. Dabei wird das fehleranfällige NHEJ primär zu Gen-Veränderungen durch Gen-Knockout verwendet. Homologie basierte Reparaturmechanismen wie MMEJ und HDR hingegen finden Anwendung in der Genkorrektur und -ersatz und sind in der Lage, in Anwesenheit eines Reparaturtemplates dieses in das Genom zu integrieren. Die Herausforderung ist es, diese Techniken so effizient und nebenwirkungsfrei wie möglich zu gestalten, damit sie im klinischen Alltag eingesetzt werden können.
Ziel dieser Arbeit war es, eine Herabregulierung des fehleranfälligen NHEJ-Reparaturweges durch den Knockout eines seiner Schlüsselenzyme zu erreichen. Dies sollte zu einer Effizienzsteigerung der konkurrierenden Reparaturmechanismen und damit zu der Verbesserung Homologie-basierter Genome Editing Strategien beitragen. Hierzu wurde die Expression des NHEJ-Schlüsselenzyms Ku70 durch einen CRISPR/Cas9 vermittelten Gen-Knockout in murinen Zelllinien inhibiert. Das Ku70 Protein ist eine Untereinheit des Ku-Heterodimers, welches mit hoher Affinität freie Doppelstrangenden bindet und in der Einleitung des NHEJ-Reparaturweges beteiligt ist. Die Abnahme der Ku70-Expression in den Knockout Zellen wurde zunächst mittels Western-Blot nachgewiesen. Hierbei konnte eine Herabregulierung des Ku70-Proteins auf 28,3 % der Ausgangsmenge erzielt werden. Der Einfluss auf die NHEJ-Aktivität wurde daraufhin mittels BRET-basierter Methodik untersucht, wobei eine reproduzierbare Abnahme der NHEJ-Events erzielt werden konnte. Die Auswirkung auf die MMEJ-Aktivität wurde mittels Luziferase-Assay beurteilt. Dabei konnte eine Abnahme der Einbaueffizienz der zugefügten Templates nach Herabregulation des NHEJ festgestellt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen auf einen bedeutenden Einfluss eines Ku70 Knockouts auf die NHEJ-Aktivität hin. In Zukunft sollten die Funktionsweisen weiterer in den Reparaturwegen involvierter Proteine untersucht werden, um ein vollständiges Verständnis über die Wechselwirkungen zu erlangen und eine Optimierung von Genome Editing Strategien zu bewirken. Therapeutic genome editing aims to correct disease-causing mutations within the genome of patients. This approach has potential application in research and in the elaboration of gene therapy treatments for ophthalmic diseases such as inherited retinal dystrophies. The principle of genome editing is based on engineered nucleases, including the popular CRISPR/Cas9-System. These nucleases generate a DNA double-strand break at a targeted gene locus. The break is then repaired by cell-own DNA repair mechanisms such as NHEJ, MMEJ and HDR. The NHEJ pathway is an error-prone process that causes small insertions and deletions and can be used for the knockout of desired gene funktions. Homology dependent repair mechanism including HDR and MMEJ allow researchers to introduce artificial repair templates into the gene to correct a mutation, or to add new traits. The challenge is to optimize genome editing strategies and the required DNA repair mechanism for a safe and efficient clinical use.
The aim of this project was to downregulate the error-prone NHEJ pathway by knocking out one of its essencial enzymes in murine cell lines, to achieve an increase in homology directed approaches. For this, the expression of Ku70 was downregulated by a CRISPR/Cas9 mediated gene knockout of its encoding gene region. The Ku70 enzyme is a subunit of the Ku-heterodimer and best characterized for its central role in the initial DNA-end binding function and further initiation of the NHEJ pathway.
The down regulation of Ku70 was first verified by a western-blot. With this, we achieved a decrease of Ku70 quantity to 28,3 % of the initial value. The NHEJ-activity was then measured by BRET-based methodology. These experiments showed a reproducible downregulation of NHEJ-events after gene knockout. The influence of the Ku70 knockdown on the MMEJ-aktivity was measured by a luciferase-assay. We observed a decrease of knock-in efficiency of the tested repair templates after knockdown.
The achieved results of this project indicate an important impact of the Ku70 knockout/ knockdown on NHEJ-aktivity. In the future, the functions of proteins involved in DNA-repair pathways should be further investigated in order to achieve complete understanding of these processes and further optimize genome editing strategies for practical application.
Ziel dieser Arbeit war es, eine Herabregulierung des fehleranfälligen NHEJ-Reparaturweges durch den Knockout eines seiner Schlüsselenzyme zu erreichen. Dies sollte zu einer Effizienzsteigerung der konkurrierenden Reparaturmechanismen und damit zu der Verbesserung Homologie-basierter Genome Editing Strategien beitragen. Hierzu wurde die Expression des NHEJ-Schlüsselenzyms Ku70 durch einen CRISPR/Cas9 vermittelten Gen-Knockout in murinen Zelllinien inhibiert. Das Ku70 Protein ist eine Untereinheit des Ku-Heterodimers, welches mit hoher Affinität freie Doppelstrangenden bindet und in der Einleitung des NHEJ-Reparaturweges beteiligt ist. Die Abnahme der Ku70-Expression in den Knockout Zellen wurde zunächst mittels Western-Blot nachgewiesen. Hierbei konnte eine Herabregulierung des Ku70-Proteins auf 28,3 % der Ausgangsmenge erzielt werden. Der Einfluss auf die NHEJ-Aktivität wurde daraufhin mittels BRET-basierter Methodik untersucht, wobei eine reproduzierbare Abnahme der NHEJ-Events erzielt werden konnte. Die Auswirkung auf die MMEJ-Aktivität wurde mittels Luziferase-Assay beurteilt. Dabei konnte eine Abnahme der Einbaueffizienz der zugefügten Templates nach Herabregulation des NHEJ festgestellt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen auf einen bedeutenden Einfluss eines Ku70 Knockouts auf die NHEJ-Aktivität hin. In Zukunft sollten die Funktionsweisen weiterer in den Reparaturwegen involvierter Proteine untersucht werden, um ein vollständiges Verständnis über die Wechselwirkungen zu erlangen und eine Optimierung von Genome Editing Strategien zu bewirken. Therapeutic genome editing aims to correct disease-causing mutations within the genome of patients. This approach has potential application in research and in the elaboration of gene therapy treatments for ophthalmic diseases such as inherited retinal dystrophies. The principle of genome editing is based on engineered nucleases, including the popular CRISPR/Cas9-System. These nucleases generate a DNA double-strand break at a targeted gene locus. The break is then repaired by cell-own DNA repair mechanisms such as NHEJ, MMEJ and HDR. The NHEJ pathway is an error-prone process that causes small insertions and deletions and can be used for the knockout of desired gene funktions. Homology dependent repair mechanism including HDR and MMEJ allow researchers to introduce artificial repair templates into the gene to correct a mutation, or to add new traits. The challenge is to optimize genome editing strategies and the required DNA repair mechanism for a safe and efficient clinical use.
The aim of this project was to downregulate the error-prone NHEJ pathway by knocking out one of its essencial enzymes in murine cell lines, to achieve an increase in homology directed approaches. For this, the expression of Ku70 was downregulated by a CRISPR/Cas9 mediated gene knockout of its encoding gene region. The Ku70 enzyme is a subunit of the Ku-heterodimer and best characterized for its central role in the initial DNA-end binding function and further initiation of the NHEJ pathway.
The down regulation of Ku70 was first verified by a western-blot. With this, we achieved a decrease of Ku70 quantity to 28,3 % of the initial value. The NHEJ-activity was then measured by BRET-based methodology. These experiments showed a reproducible downregulation of NHEJ-events after gene knockout. The influence of the Ku70 knockdown on the MMEJ-aktivity was measured by a luciferase-assay. We observed a decrease of knock-in efficiency of the tested repair templates after knockdown.
The achieved results of this project indicate an important impact of the Ku70 knockout/ knockdown on NHEJ-aktivity. In the future, the functions of proteins involved in DNA-repair pathways should be further investigated in order to achieve complete understanding of these processes and further optimize genome editing strategies for practical application.
| Erscheinungsdatum | 10.01.2022 |
|---|---|
| Reihe/Serie | Edition Scientifique |
| Verlagsort | Gießen |
| Sprache | deutsch |
| Maße | 148 x 210 mm |
| Gewicht | 250 g |
| Themenwelt | Studium ► 2. Studienabschnitt (Klinik) ► Humangenetik |
| Schlagworte | Cas9 • CRISP • Gene |
| ISBN-10 | 3-8359-7008-9 / 3835970089 |
| ISBN-13 | 978-3-8359-7008-3 / 9783835970083 |
| Zustand | Neuware |
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