Etablierung von micro-RNA Microarrays und deren Verwendung zur Analyse hypoxieinduzierter Regulation in hu-manen Fibroblasten der pulmonalvaskulären Adventitia
Seiten
2015
VVB Laufersweiler Verlag
978-3-8359-6370-2 (ISBN)
VVB Laufersweiler Verlag
978-3-8359-6370-2 (ISBN)
- Keine Verlagsinformationen verfügbar
- Artikel merken
Die pulmonalarterielle Hypertonie ist durch eine chronische Druckerhöhung des pulmonal-arteriellen Mitteldruckes gekennzeichnet. Pathogenetisch bedeutsam ist die Trias von Vasokonstriktion, Thrombose und Gefäßumbauprozessen (Remodelling) in den Pulmonalgefäßen. Die Erkrankung führt zu Belastungsdyspnoe, Cor pulmonale und Rechtsherzdekompensation. In der Frühphase der Erkrankung spielen pathogenetische Prozesse in pulmonalvaskulären Fibroblasten der Adventitia vermutlich eine wichtige Rolle. Die Beteiligung von microRNAs (miRNAs) hierbei ist kaum untersucht.
Die Ziele dieser Arbeit gliedern sich in mehrere Schritte. Zunächst soll eine möglichst robuste Plattform für das Labelling, die Hybridisierung und die Auswertung von miRNA-Microarrays etabliert werden. Im Anschluss sollen humane pulmonalarterielle Fibroblasten auf die Regulation von miRNAs unter 24h Hypoxie untersucht werden. Die zelluläre Antwort auf miRNA-Ebene soll schließlich mit bekannten Faktoren des adven-titiellen Remodellings von Pulmonalarterien bei pulmonalearterieller Hypertonie ver-knüpft werden.
Fibroblasten humaner Pulmonalarterien wurden kultiviert und für 24h unter Normoxie oder Hypoxie (FiO2=1%) inkubiert. Mit einer Phenol-Guanidin-basierten Methode erfolgte die Extraktion der gesamten RNA. Der Erfolg der Hypoxie-Stimulation wurde durch die Messung des Gens PGK1 mittels Real-Time-PCR bestätigt. Die miRNA wurde mit Hilfe einer T4-Ligase an einen Cy-Farbstoff-konjugiertes Oligoribonukleotid gebunden. Die farbstoffmarkierten miRNAs wurden nach Vergleich verschiedener Microarray-Hersteller auf miChip-Microarrays hybridisiert. Die Validierung der miRNA-Expression erfolgte mittels qRT-PCR. Zur Datenverarbeitung wurde die Software R verwendet. Die miRNA-Zielgenvorhersage und Verknüpfung mit KEGG-Signalwegen erfolgte gestützt auf einen selbst entwickelten Algorithmus. Dessen Ergebnisse wurden mit der KEGG-Signalweg-Analyse basierend auf Agilent Whole Genome Microarrays verglichen.
In der Etablierungsphase ergab die vergleichende Durchführung verschiedener Me-thoden Vorteile für T4-Ligase-vermitteltes Labelling auf miChip Microarrays. Die Microarray-Analyse ergab dass Hypoxie in den untersuchten Fibroblasten miR-210, -744 und -296 induzierte, und miR-183 supprimierte. Die qRT-PCR validierte mit Aus-nahme von miR-296 die Regulation der identifizierten miRNAs signifikant. Die kompa-rative Signalweg Analyse ermittelte etwa 60% der durch den entwickelten Algorithmus vorhergesagten Signalwege auch über mRNA-Microarrays.
Insbesondere miR-210, eine wichtige HIF-1α-/-2α-induzierte und bekannt hypoxie-regulierte miRNA, jedoch auch miR-183 und -744 können über ihre Zielgene mit pa-thogenetischen Mechanismen der PAH wie Angiogenese, Remodelling, Zelldifferenzie-rung und Zellzyklusarrest verknüpft werden. Ihre Bedeutung im Zusammenhang mit pulmonalarterieller Hypertonie war bisher unbekannt und führt gleich zu mehreren po-tentiellen Ansätzen weiterführender Forschung. Der entwickelte Algorithmus zur Sig-nalweganalyse basierend auf miRNA-Microarrays zeigt vergleichbare Ergebnisse zur Signalweganalyse über mRNA-Microarrays und ist damit eine interessante Möglichkeit zur weiterführenden Betrachtung des biologischen Kontexts von miRNA-Microarray-Ergebnissen.
Die Ziele dieser Arbeit gliedern sich in mehrere Schritte. Zunächst soll eine möglichst robuste Plattform für das Labelling, die Hybridisierung und die Auswertung von miRNA-Microarrays etabliert werden. Im Anschluss sollen humane pulmonalarterielle Fibroblasten auf die Regulation von miRNAs unter 24h Hypoxie untersucht werden. Die zelluläre Antwort auf miRNA-Ebene soll schließlich mit bekannten Faktoren des adven-titiellen Remodellings von Pulmonalarterien bei pulmonalearterieller Hypertonie ver-knüpft werden.
Fibroblasten humaner Pulmonalarterien wurden kultiviert und für 24h unter Normoxie oder Hypoxie (FiO2=1%) inkubiert. Mit einer Phenol-Guanidin-basierten Methode erfolgte die Extraktion der gesamten RNA. Der Erfolg der Hypoxie-Stimulation wurde durch die Messung des Gens PGK1 mittels Real-Time-PCR bestätigt. Die miRNA wurde mit Hilfe einer T4-Ligase an einen Cy-Farbstoff-konjugiertes Oligoribonukleotid gebunden. Die farbstoffmarkierten miRNAs wurden nach Vergleich verschiedener Microarray-Hersteller auf miChip-Microarrays hybridisiert. Die Validierung der miRNA-Expression erfolgte mittels qRT-PCR. Zur Datenverarbeitung wurde die Software R verwendet. Die miRNA-Zielgenvorhersage und Verknüpfung mit KEGG-Signalwegen erfolgte gestützt auf einen selbst entwickelten Algorithmus. Dessen Ergebnisse wurden mit der KEGG-Signalweg-Analyse basierend auf Agilent Whole Genome Microarrays verglichen.
In der Etablierungsphase ergab die vergleichende Durchführung verschiedener Me-thoden Vorteile für T4-Ligase-vermitteltes Labelling auf miChip Microarrays. Die Microarray-Analyse ergab dass Hypoxie in den untersuchten Fibroblasten miR-210, -744 und -296 induzierte, und miR-183 supprimierte. Die qRT-PCR validierte mit Aus-nahme von miR-296 die Regulation der identifizierten miRNAs signifikant. Die kompa-rative Signalweg Analyse ermittelte etwa 60% der durch den entwickelten Algorithmus vorhergesagten Signalwege auch über mRNA-Microarrays.
Insbesondere miR-210, eine wichtige HIF-1α-/-2α-induzierte und bekannt hypoxie-regulierte miRNA, jedoch auch miR-183 und -744 können über ihre Zielgene mit pa-thogenetischen Mechanismen der PAH wie Angiogenese, Remodelling, Zelldifferenzie-rung und Zellzyklusarrest verknüpft werden. Ihre Bedeutung im Zusammenhang mit pulmonalarterieller Hypertonie war bisher unbekannt und führt gleich zu mehreren po-tentiellen Ansätzen weiterführender Forschung. Der entwickelte Algorithmus zur Sig-nalweganalyse basierend auf miRNA-Microarrays zeigt vergleichbare Ergebnisse zur Signalweganalyse über mRNA-Microarrays und ist damit eine interessante Möglichkeit zur weiterführenden Betrachtung des biologischen Kontexts von miRNA-Microarray-Ergebnissen.
| Erscheint lt. Verlag | 11.11.2015 |
|---|---|
| Reihe/Serie | Edition Scientifique |
| Sprache | deutsch |
| Maße | 146 x 210 mm |
| Gewicht | 230 g |
| Einbandart | Paperback |
| Themenwelt | Medizin / Pharmazie ► Allgemeines / Lexika |
| Schlagworte | Doktorarbeit • Uni • Wissenschaft |
| ISBN-10 | 3-8359-6370-8 / 3835963708 |
| ISBN-13 | 978-3-8359-6370-2 / 9783835963702 |
| Zustand | Neuware |
| Haben Sie eine Frage zum Produkt? |
Mehr entdecken
aus dem Bereich
aus dem Bereich
medizinischer Grundwortschatz und Fachwörterlexikon für Pflegeberufe
Buch | Softcover (2022)
Börm Bruckmeier Verlag
CHF 26,60
Kleines Lexikon - medizinische Fachbegriffe, Fremdwörter und …
Buch | Softcover (2021)
Börm Bruckmeier (Verlag)
CHF 26,60
